内质网应激在SNX-2112诱导食管癌细胞死亡中的作用

Molecular-targeting drug has been the focus in cancer therapy. Heat shock protein 90 is a well-known anti-cancer target. Previously we found synthetic tetrahydroindazolone compound SNX-2112, as a novel Hsp90 inhibitor, could remarkably inhibit the growth of esophageal cells, down-regulate expression of endoplasmic reticulum stress (ERS) proteins such as GRP78, and activate apoptosis and autophagy pathway. Basing on this, to study the mechanisms of esophageal therapy, SNX-2112 could be used as the breakthrough point through its ability to block ERS and induce cell death. The contents of this project include the following: investigate whether SNX-2112 affects on proteins by interact with GRP78 and consequently blocks functions of ERS protein; evaluate whether SNX-2112-blocked ERS could induce apoptosis, autophagy and other cell death pathways; establish esophageal cancer nude mouse xenograft model, and evaluate the anti-cancer activity of SNX-2112 in the model; determine the contribution of SNX-2112-blocked ERS in the treatment of patients with esophageal. This project not will not help to elucidate the esophageal cell death mechanisms induced by SNX-2112, but also provide a new strategy of esophageal chemotherapy.

分子靶向药物是食管癌治疗的研究重点，热休克蛋白Hsp90已成为国际公认的抗癌新靶点。申请者长期研究的四氢吲唑酮类化合物SNX-2112是新型Hsp90抑制剂。前期研究发现：①SNX-2112抑制食管癌细胞生长，且效果比5-FU高出近100倍；②GRP78、PERK、IRE1等内质网应激（ERS）相关蛋白表达下调；③细胞死亡（凋亡及自噬）通路被激活。基于此，本题拟以SNX-2112阻断ERS、诱导细胞死亡为切入点，①应用细胞生物学、肿瘤药理学手段，证实SNX-2112通过影响GRP78相互作用而使ERS阻断；②工具药增强或阻滞ERS后，研究SNX-2112对凋亡及自噬等死亡通路的影响；③在裸鼠体内评价SNX-2112抗食管癌药效，联合用药探讨ERS在SNX-2112治疗食管癌中的作用。本课题将为阐明SNX-2112诱导食管癌细胞死亡机制提供科学依据，同时也为食管癌提供一种全新的化疗策略。

SNX-2112是近年来正在开发的一种新型Hsp90抑制剂，课题组前期进行了临床前的药理学及毒理学研究，以及对慢性白血病、黑色素瘤、乳腺癌细胞的作用及机制研究，发现SNX-2112具有良好的抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制可能与细胞凋亡及自噬有关。据文献报道，Hsp90在食管癌细胞和组织中存在高表达，可能是食管癌潜在的治疗靶点。基于此，我们的研究工作以内质网应激（细胞凋亡和自噬的上游调控开关）为切入点，研究了内质网应激在Hsp90抑制剂SNX-2112抗肿瘤中的作用。结果表明：（1）SNX-2112抑制食管癌细胞生长、且具有浓度依赖性；SNX-2112将食管癌细胞周期阻滞在G2/M期；可浓度依赖性地诱导Hsp90客户蛋白降解；诱导食管癌细胞产生凋亡小体、PARP断裂、以及促凋亡蛋白Bax的表达；SNX-2112诱导食管癌细胞LC3Ⅱ型自噬蛋白的上调；SNX-2112能引起内质网结构蛋白Calnexin的下调，并抑制内质网应激蛋白GRP78和非折叠蛋白质反应相关蛋白PERK、IRE1α的表达。（2）化学致癌剂4NQO采用饮水法摄入16周，可成功建立C57BL/6小鼠食管鳞癌模型，模型中Hsp90、Akt及CyclinD1均有显著高表达；Hsp90抑制剂SNX-2112通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡抑制肿瘤进展，机制可能涉及客户蛋白Akt、CyclinD1的抑制。（3）SNX-2112治疗组对ECA-109实体瘤的抑瘤率为47%（p<0.01），对Ec9706实体瘤的抑瘤率为31%（p<0.01）；Western blot结果表明，SNX-2112能够在裸鼠体内诱导食管癌细胞发生凋亡和自噬；能下调内质网应激及UPR通路中GRP78，IRE1及PERK蛋白表达。（4）内质网应激诱导剂TG可消弱SNX-2112诱导的细胞凋亡；内质网应激抑制剂TUDCA能够显著增强SNX-2112诱导的细胞凋亡。结论：在本文中我们证明，SNX-2112在细胞和动物模型中均能引起细胞凋亡、自噬和内质网应激水平的改变。内质网应激抑制剂TUDCA能够显著增强SNX-2112诱导的细胞凋亡。本研究为SNX-2112体内外诱导细胞凋亡的机制研究提供了基础，初步建立了内质网应激与SNX-2112诱导食管癌细胞凋亡之间的联系，同时也将为将来SNX-2112治疗食管癌的临床应用提供理论依据。