ROS介导的谷胱甘肽化在上皮间充质转化中的功能和作用机制研究

Reactive oxygen species (ROS) are the most important biomolecules and play important roles in almost all biological and pathological processes including epithelial-mesenchymal transition and liver fibrosis. Glutathione as one of the most abundance molecules in cells is an essential component of the anti-oxidant system. Under oxidative stress, proteins and metabolites are glutathionylated that protects proteins from excessive and irreversible oxidation and detoxify reactive species. Our long term goal is to understand molecular mechanisms of the redox homeostasis network in ROS regulation and its roles in aging and aging-associated diseases. The specific aims of the present proposal include (1) establishing stable cell lines for expressing GSH synthase mutant, which can use azido-alanine for generating clickable GSH probes; and identifying EMT associated protein glutathionylation; (2) finding an GST mutant that can accommodate clickable GSH for reacting with cellular electrophiles and developing a new method to identify endogenous glutathionylated metabolites; and (3) identifying changes in glutathionylome in mouse models of live fabrosis for developing biomarkers of oxidative stress. The work proposed herein is to establish a reproducible techniques to investigate the functions of glutathionylation that play important roles in biological processes. The completion of the proposed work will establish the role of glutathionylation as a major regulator in EMT and fabrosis. The methods established in the present work for characterization of protein glutathionylation are useful tools for studying other biological systems.

细胞中的活性氧分子（ROS）在上皮间充质转化（EMT）和器官纤维化等生理过程中发挥着重要作用。ROS和细胞抗氧化体系相互作用导致蛋白质和代谢产物发生谷胱甘肽（GSH）化修饰。鉴定这些被GSH修饰的分子对理解ROS的作用机制具有重要意义。我们在前期工作中已建立了体外检测药物二相代谢产物和蛋白质谷胱甘肽化的方法，本课题拟发展一套定量检测体系来系统鉴定EMT和肝纤维化过程中谷胱甘肽化的内源性分子。具体的研究目标包括建立表达谷胱甘肽合成酶/转移酶突变体的稳转细胞系，通过代谢反应合成可发生点击化学反应的GSH探针分子；发展富集和检测方法鉴定EMT和肝纤维化相关过程中被GSH修饰的蛋白和内源性代谢产物；阐明谷胱甘肽化对细胞代谢通路和EMT过程的影响并开发表征肝纤维化相关氧化损伤的生物标志物。本项研究开发的检测体系可以改变修饰蛋白质组学重现性低的现状，并用于二相代谢过程以及重要蛋白谷胱甘肽化功能的研究。

活性氧可以通过驱动蛋白的氧化修饰损伤导致衰老相关疾病的发生发展。鉴定生物学过程中发生谷胱甘肽化和磺酸化修饰的蛋白是本课题的研究目标。本课题的主要研究内容是建立富集和鉴定氧化修饰蛋白的方法，系统鉴定细胞发生上皮间充质转化过程（EMT）中谷胱甘肽化和磺酸化的蛋白，并进一步研究这些蛋白翻译后修饰的功能和调控。本课题取得了以下研究结果：（1）建立了表达谷胱甘肽合成酶变异体的稳转细胞系，这个工程化的细胞可以利用带叠氮的丙氨酸来合成可以发生点击化学反应的谷胱甘肽类似物的探针（c-GSH），从而标记细胞中内源性的可被GSH修饰的分子；（2）作为水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的关键蛋白，高表达CD38促使细胞发生EMT过程，因此我们构建了CD38高表达的稳转细胞系作为研究EMT的细胞模型；（3）优化了谷胱甘肽化蛋白的富集方法，系统鉴定了CD38高表达细胞中蛋白谷胱甘肽化修饰的整体变化，发现谷胱甘肽化修饰水平发生显著变化的蛋白大多集中在EMT相关的通路上；（4）深入研究了15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）谷胱甘肽化的生物学功能，发现 15-PGDH上63位半胱氨酸的谷胱甘肽化修饰水平在EMT中显著升高，其谷胱甘肽化修饰抑制了15-PGDH的催化活性；（5）基于二氧化钛发展了一种新的半胱氨酸磺酸化修饰富集体系，并系统鉴定了EMT中蛋白磺酸化修饰的变化，为后续磺酸化修饰的功能研究提供了数据资源；（6）深入研究了二氢叶酸还原酶（DHFR）磺酸化修饰的功能，首次发现DHFR上第7位半胱氨酸的磺酸化修饰可介导DHFR发生氧化降解，增加细胞对于铁死亡的敏感性，为磺酸化修饰介导氧化降解提供了新的证据，也建立CD38高表达和铁死亡之间的关系；（7）NAD前体可以通过减低细胞内活性氧水平增加15-PGDH的活性和DHFR的稳定性，从而增加细胞的抗炎能力并降低细胞对铁死亡的敏感性。