二硫键异构酶ERp72双重调控血小板与凝血系统活化的作用与机制

Thrombosis is an integrated process of platelet activation and coagulation, its mechanism remains elusive. The family of protein disulfide isomerases（PDIs）includes 20 members of thiol isomerases that regulate the activities of functional proteins via redox control of their thiol-disulfide exchange. Recently we have reported that PDI and ERp57 of this family play an important role in thrombosis, however, the roles of other members of PDI family still remain unknown. Our recent preliminary studies suggest that ERp72 plays a more important role than PDI and ERp57 in platelet activation, and it also regulates the platelet accumulation and fibrin deposition in vivo. Thus, ERp72 mediates thrombosis by dual regulation of platelet activation and coagulation. To determine the cellular and molecular mechanisms underlying the role of ERp72 in thrombosis, we will utilize tissue-specific ERp72-deficient mouse model, in vivo thrombosis model, platelet aggregation, flow cytometry, mass spectrometry and thrombin generation assays. Therefore, our studies will not only reveal the novel mechanism for thrombosis, but will also identify new therapeutic target for antithrombotic treatment.

血栓形成是血小板活化和凝血系统激活导致的血液凝固，其启动机制尚不清楚。二硫键异构酶（PDI）家族调控功能性蛋白二硫键的氧化还原，该家族有20个成员。我们近来报道，该家族中的ERp57和PDI参与血栓形成过程，但是其它成员在血栓形成中的作用不清楚。我们最近的研究发现，ERp72调控体内血小板积聚及纤维蛋白形成，且ERp72在血小板活化中比PDI和ERp57发挥更重要的作用，结果提示ERp72通过双重调控血小板活化和凝血系统激活在血栓形成中发挥重要作用。为剖析ERp72在体内血栓形成中调控血小板活化和凝血系统激活的细胞与分子机制，我们将应用ERp72组织特异性基因敲除小鼠模型、活体成像血栓形成模型、血小板聚集、流式细胞术、质谱分析和凝血酶生成等综合手段。本项目旨在明确ERp72在血栓形成中的重要作用和机制，为阐明血栓形成的启动机制提供新的突破性认识，并推动以ERp72为靶点的抗血栓药物的研发。

近来众多含有CXYC活性位点的二硫键异构酶家族成员，如PDI、ERp57、ERp5以及TMX1等，被证实在血栓形成中发挥正向或负向调控作用，而另一成员ERp72含有3个CGHC（ao，a and a’)氧化还原活性位点，其在血栓形成中的作用及机制不清楚，因此我们开展了此项研究。我们新制备内皮-造血系条件性敲除ERp72小鼠模型(Tie2-Cre/ERp72-/-)，发现该模型小鼠和对照小鼠相比出血时间明显延长，且在体内激光损伤诱导提睾肌动脉血栓形成和FeCl3诱导体内肠系膜动脉血栓形成实验中，发现该模型小鼠体内血小板积聚均显著减少，且在激光损伤诱导提睾肌动脉血栓形成模型中还发现纤维蛋白生成减少。体内注入将a区域CGHC突变而保留a和a’功能性CGHC正常的ERp72（oo-ss-ss）重组蛋白可充分补偿该小鼠模型体内血小板积聚和纤维蛋白形成的缺陷。体内注入将a区域CGHC保留正常而a和a’区域CGHC突变失活的ERp72（ss-oo-oo）重组蛋白可显著抑制野生型小鼠体内血小板积聚和纤维蛋白形成。向缺乏血小板积聚的beta3敲除小鼠体内注入ERp72（oo-ss-ss）重组蛋白仍促进其体内纤维蛋白形成。ERp72敲除血小板在血小板聚集，活化型aIIbb3抗体JON/A的结合，P-selectin的表达以及ATP释放等功能上均表现有缺陷，且血小板聚集以及ATP释放等功能的缺陷能被ERp72（oo-ss-ss）蛋白充分补偿，能被ERp72（ss-oo-ss）或ERp72（ss-ss-oo）部分补偿。ERp72（oo-ss-ss）蛋白促进人血小板聚集和ATP释放而ERp72（ss-oo-ss）蛋白或ERp72（ss-ss-oo）蛋白均抑制人血小板聚集和ATP释放。以上结果提示ERp72蛋白中a和a’活性位点是血小板功能所必需的。ERp72蛋白在beta3敲除血小板表面结合减少，且ERp72（oo-ss-ss）蛋白孵育人血小板可增加其整合素aIIbb3的巯基，提示ERp72直接作用于整合素aIIbb3。ERp72蛋白而不是其它成员蛋白能补偿ERp72敲除血小板在血小板聚集功能上的缺陷。总之，ERp72通过其a和a’功能性CGHC调控血小板功能以及凝血系统活化。此研究填补了人们对ERp72正向调控血栓形成的认识的空白，也为抗血栓药物的研发提供了新的靶向。