木聚糖酶催化反应机理的研究及耐酸碱突变体的设计

Xylanase is a typical glycosidase to break up the glycosidic band in xylan using the acid/base mechanism and have wide applications in pulp, food, and feed industries. Mutating enzyme to have optimal pH at alkaline or acidic environment has great potential in industries. Understanding the reaction mechanism could provide guideline for rational design of protein engineering. Currently, the protonation states of the key residues, ligands and waters have not been directly observed. Thus, the reaction mechanism of xylanase needs to be further elucidated. We have previously obtained the neutron crystallography structures of ligand-free enzymes under different conditions and studied the protonation states of key residues and water. We aims to further obtain neutron-diffracted structures of protein complexes, including the null enzyme-substrate complex, the enzyme-intermediate analog complex and the enzyme-product complex. Neutron diffracted structures can provide detailed informations of hydrogen atoms, which are difficult to visualize using X-ray crystallography, cryo-electron microscopy and nuclear magnetic resonance. The above neutron crystal structures will pave the way to studying the reaction mechanism, which involves interactions among xylanase, ligand and water, particularly their protonation states. Our project will adjust the hydrogen network inside the active site to modify the electrostatic environment, which determines the optimal reaction pH during catalysis. This rational design will help to generate a superenzyme whose optimal reaction pH is in the alkaline or acidic condition and has great potential in industry.

木聚糖酶通过酸碱催化机制来断裂木聚糖中糖苷键，在造纸、食品和饲料等行业都有广泛的应用。研究以木聚糖酶为代表的糖苷酶的催化机理，尤其是质子穿梭在断裂糖苷键中的重要作用，对于调节酶最适反应pH值，获得耐酸或耐碱的超级酶，具有重要的理论指导意义。但是，酶活性中心的质子穿梭很难被直接观测到，使得催化机理的研究难以被验证。项目组前期已获得无配体木聚糖酶的中子衍射晶体结构，并将进一步研究无活性突变酶同底物、酶与中间产物类似物、酶与产物等复合物的中子衍射晶体结构，精确地获得用X-光衍射、核磁共振和冷冻电镜等常规手段难以获得的酶、配体和水分子中质子的动态变化，深入地探讨催化机制；通过木聚糖酶与其它糖苷酶水解机制的比较，分析归纳出糖苷酶水解的普遍规律。在上述研究的基础上，尝试改变酶活性中心复杂的氢键网络及其所决定的静电环境，获得热稳定性高、耐酸碱的工程酶，为提高木聚糖酶在工业上的实用性打下理论基础。

糖苷水解酶可以高效地断裂寡糖或多糖中的糖苷键，在食品、饲料、造纸、生物能源、医药等多方面都有广泛的应用。研究糖苷酶的催化反应机理，对于改造糖苷酶并应用于工农业生产，具有重要的理论指导意义。里氏木霉表达分泌的第11家族β-1,4-木聚糖内切酶是一个非常典型的糖苷水解酶。本报告以此木聚糖酶为模型，深入探讨糖苷酶的水解反应机制并加以改造，提高其在极端环境下的活性。.本课题联合采用蛋白质晶体X-光和中子衍射技术研究以木聚糖酶为代表的糖苷酶的催化反应机理。X-光衍射可以获得晶体中C、N、O、S等原子的空间位置。中子衍射可以获得反应体系中H原子的空间位置，这对于研究酶催化过程中质子是如何在催化氨基酸、水分子和底物三者间穿梭，从而断裂糖苷键的详细过程，具有独特的优势。本课题获得了野生型木聚糖酶、N44D、Y88F、Y77F单突变以及N44E/E177Q、N44D/E177Q、N44E/E177N等双突变与底物的X-光衍射晶体结构，并获得了酶在不同pH条件下的中子衍射晶体结构。以上结果表明，活性中心的谷氨酸177作为质子的供体和受体，具有向上的“upward”和向下的“downward”两种构象。在“downward”构象中，谷氨酸177作为广义的碱从溶剂水分子获得质子，在“upward”构象中，谷氨酸177作为广义的酸提供质子。在最适pH环境下，E177的上述两种构象能快速地达到平衡，从而高效地作为质子载体并断裂糖苷键。E177与活性中心Y88之间的氢键强度随着环境pH不同发生变化，从而决定了酶反应的最适pH值。突变活性中心非催化氨基酸N44为D44，可以改变E177的静电环境，从而降低酶的最适pH值。.课题组还进行了一系列理性突变实验，旨在获得热稳定性提高的突变酶。通过大量解折叠自由能计算，获得热稳定性高的潜在突变。再通过序列分析和晶体结构中的B-因子筛选，最终获得稳定性提高的9突变。最后，我们建立了枯草芽孢杆菌表达和胞外分泌系统，初步建立了一套高通量活性筛选的方法。