胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽靶向治疗作用的研究

肿瘤的转移具有器官选择性，胃癌发生肝脏转移也是器官选择性的结果，目前尚无有效防治胃癌肝转移的方法。我们在前期工作中筛选出可与胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合的多肽分子pd20，并证实此多肽可以与具有肝转移能力的胃癌细胞和组织特异结合。为了进一步研究多肽pd20是否具有胃癌肝转移的导向性，能否携带抗癌药物靶向性治疗胃癌肝转移。本项目欲首先对多肽pd20胃癌肝转移的导向性进行体内、体外特异性检测；明确其导向性后，选取高效、低毒重组突变人肿瘤坏死因子（rmhTNF）作为抗肿瘤药物，利用基因重组技术，克隆pd20-rmhTNF的融合基因、诱导融合蛋白表达、纯化该蛋白，并进行体外活性和杀伤能力检测；进一步通过裸鼠体内实验来研究重组蛋白靶向性治疗胃癌肝转移的作用，并通过高通量筛选方法筛选与其作用的靶向蛋白，为开发新的靶向治疗胃癌肝转移药物奠定理论和实验基础。

肝转移是晚期胃癌患者主要的死亡原因之一，由于同一类型的肿瘤中不同亚系存在，导致转移的特性不同，我们在前期工作中筛选出可特异性结合于胃癌肝高转移潜能细胞的多肽分子pd20，此多肽是否具有胃癌肝转移的靶向性，是否能携带抗癌药物起到靶向性治疗胃癌肝转移的作用，为此我们进行了相关研究。.目的：在证实多肽pd20具有胃癌肝转移导向性的基础上，将pd20与TNFα进行基因重组并克隆，诱导蛋白表达，并纯化。进一步通过裸鼠体内外实验观察融合蛋白是否具有靶向性治疗和预防胃癌肝转移的作用。.方法：1.构建胃癌肝转移的模型，通过归巢实验鉴定pd20噬菌体在胃癌肝转移裸鼠体内不同部位的的归巢情况。2.免疫荧光实验检测多肽pd20在模型鼠体内的荧光分布情况。3.利用全基因合成法制备pd20-TNFα融合基因，构建pd20-TNFα原核表达载体，并进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测分析；4. Ni-NTA柱法纯化融合蛋白，L929 细胞毒法进行生物学活性检测。流式凋亡实验和侵袭实验观察融合蛋白对胃癌肝高转移潜能细胞的凋亡和转移能力的影响。5.通过裸鼠体内实验观察融合蛋白是否具有预防和治疗胃癌肝转移的作用。.结果 1. pd20噬菌体在胃癌和胃癌肝转移组织中回收滴度明显高于心、脾、肾等正常组织。将多肽pd20携带绿色荧光，注入模型鼠体内，发现绿色荧光主要分布于胃癌和胃癌肝转移组织，而其他正常组织中荧光分布很少，证实了pd20具有胃癌肝转移的导向性。2.成功构建了pd20-TNFα重组融合质粒，经SDS-PAGE电泳分析，在21KD处有新生条带。3. 通过Ni-NTA柱纯化，在咪唑浓度为200mM时获得纯化的目标融合蛋白，电泳普带扫描分析表明蛋白纯度可达92%。4. L929细胞毒法显示：pd20-TNFα融合纯化蛋白对L929细胞有明显的杀伤力；凋亡和细胞侵袭实验显示：融合蛋白可促进胃癌细胞的早期凋亡，可抑制XGC9811-L细胞的体外侵袭能力。4.裸鼠实验显示：融合蛋白可减少胃癌肝转移灶的数目和肝转移发生率，其毒副作用较阿霉素和TNFα低，但无预防胃癌肝转移的作用。.结论：证实了多肽pd20具有胃癌肝转移的导向性，成功将pd20与TNF基因相融合，并通过转移相关的体内外实验证实融合蛋白具有靶向性治疗胃癌肝转移的作用，毒副作用较阿霉素和TNFα低，但无预防作用。