PhnJ催化的有机膦化合物中碳磷键断裂的酶反应机制研究

C-P lyase was demonstrated that it performs efficiently biodegrade a broad of phosphonates. PhnJ, one of the proteins in C-P lyase,is in charge of directly C-P bond cleavage and is believed to be a novel radical SAM protein with rare mechanistic studies. In this proposal, the PhnJ study system will be set up with soluble protein and reconstituted Fe/S cluster. The substrate will be (bio)synthesized for the activity assay. Thsetting up of the PhnJ catalytic system will pave the way for understanding the enzymatic catalytic mechanism.

碳磷键裂解酶复合体(C-P lyase)可以有效催化多种有机膦化合物的降解，此酶复合体中的PhnJ作为关键酶参与碳磷键的直接断裂，并被鉴定为具有新颖序列的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）自由基金属蛋白酶，但此酶的催化活性非常低，仅能够完成1-4个催化循环，并且酶反应催化机理方面的研究也亟待完善。本课题以PhnJ为研究对象，通过优化体外表达纯化，并对铁硫簇体辅酶进行体内外的重构，利用化学或生物的方法合成底物，力争建立PhnJ体外催化体系的研究方法，为进一步的深入的酶学反应机制研究打下基础。

使用分子生物克隆技术完成了目的厌氧蛋白大肠杆菌来源的PhnJ表达质粒的构建，纯化获得含有亲和性标签的可融性蛋白。代谢途径中其他关键PhnG、PhnH、PhnI、PhnL蛋白表达及纯化，为途径中化合物中间体的生物合成提供了研究基础。无氧条件下实现了PhnJ蛋白的关键辅酶铁硫簇的体外重构，尝试建立PhnJ体外催化体系的建立。