骨软骨双相复合支架镶嵌成形术联合可注射性基因增强组织工程修复膝关节大面积骨软骨损伤

The therapies for large-sized osteochondral compound defects of knee did not obtain ideal therapeutic effect. Mosaicplasty is a new therapy. However autogenous osteochondral cylinders donor is often not enough to deal with large-sized osteochondral compound defects, and malintegration of the gaps among the osteochondral cylinders affect the long-term therapeutic effect. Biphase osteochondral scaffold is only used for small osteochondral defect. The key of this research is to accelerate integration of gaps among biphase osteochondral scaffolds instead of autogenous osteochondral cylinders in mosaicplasty. We obtain adipose mesenchymal stem cells(ADSCs) from subcutaneous fat of small pig. The CD105+/CD34-ADSCs are selected for seeding cells of gene therapy, which are tranfected respectively with nanoparticles vector carrying chondrogenesis or osteogenesis genes. Then osteochondral compound defects models in knees are created. When the mosaicplasty is performed, the injective tissue engineering bone and cartilage constructed by the gene-transfected CD105+/CD34-ADSCs compounded with alginate are filled layeredly in the interspace among the biphase osteochondral scaffolds, that is "dead area". This study use the mosaicplasty to reconstruct forceful subchondrol bone and smooth cartilage face in first-stage combined biphase osteochondral scaffold, polygene enhanced tissue engineering, injective tissue engineering in situ and ADSCs, and provide a new methods to rapair large-sized osteochondral compound defects.

膝关节大面积骨软骨复合损伤的各种治疗方法都有一定的缺点。骨软骨镶嵌成型术的骨软骨柱供体来源有限；单枚的双相骨软骨复合支架直径过大不利于细胞和组织的生长替代，仅适用于小面积的骨软骨损伤。能否使用双相骨软骨复合支架治疗大面积的骨软骨复合损伤是本研究中心所在。本研究以小型猪为对象，以脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）作为基因治疗的种子细胞，以纳米颗粒为载体将促骨、软骨形成的基因转染CD105+/CD34-ADSCs；然后制备膝关节大面积骨软骨复合损伤模型，使用多枚小直径双相支架替代自体骨软骨柱以Mosaicplasty术填充大部分缺损后，基因转染的CD105+/CD34-ADSCs与水凝胶藻酸钙构建可注射式组织工程骨和软骨原位注射修复"死区"，将双相复合支架、镶嵌成型技术、基因增强组织工程，原位注射式组织工程，以及ADSCs相结合，一期重建坚强的软骨下骨和平整的软骨面。

膝关节大面积骨软骨复合损伤的各种治疗方法都有一定的缺点。骨软骨镶嵌成型术的骨软骨柱供体来源有限；单枚的双相骨软骨复合支架直径过大不利于细胞和组织的生长替代，仅适用于小面积的骨软骨损伤。能否使用双相骨软骨复合支架治疗大面积的骨软骨复合损伤是本研究中心所在。本研究以小型猪为对象，以脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）作为基因治疗的种子细胞，以腺病毒为载体将促骨、软骨形成的基因BMP4转染CD90+/CD34-ADSCs；然后制备膝关节大面积骨软骨复合损伤模型，使用多枚小直径双相支架替代自体骨软骨柱以Mosaicplasty术填充大部分缺损后，BMP4基因转染的CD90+/CD34-ADSCs与水凝胶藻酸钙构建可注射式组织工程骨和软骨原位注射修复"死区"，将双相复合支架、镶嵌成型技术、基因增强组织工程，原位注射式组织工程，以及相结合，一期重建坚强的软骨下骨和平整的软骨面。在实验中我们从小型猪脂肪组织中分离并培养了，通过不同的诱导条件，证实了ADSCs有向脂肪、骨及软分化的能力。并证实了腺病毒重组BMP4能高效的转染ADSCs，转染效率能达到72.23%，免疫荧光检测证实转染后BMP4能在ADSCs中表达。通过ELISA证实在转染BMP4基因后，Bmp4，Sox9，Runx2，Col I和ColII，碱性磷酸酶在蛋白水平的表达均有增高（P<0.05），BMP4促进ADSCs分泌成骨和成软骨特异性因子，诱导其向骨和软骨分化。动物实验分为三组，动物实验分为3组，在小型猪膝关节內髁髁负重区做一直径8.5毫米，深度5毫米骨软骨缺损后，第一组仅在膝关节內髁骨软骨缺损区镶嵌植入3枚直径3.5毫米骨软骨双相支架；第二组在骨软骨双相支架间的空隙注射藻酸钙凝胶；第三组在骨软骨双相支架间的空隙注射藻酸钙-ADSC-BMP4凝胶。因为本项目资助时间较短，而动物体内实验需要时间较长，相应的标本检测工作将在后续工作中完成。