基于枯草芽孢杆菌功能膜微域支架的N-乙酰氨基葡萄糖代谢调控研究

The spatial tissue metabolic engineering, an important research method of metabolic engineering, can reduce barriers to transfer intermediates and significantly improve the reaction efficiency through constructing artificial substrate channels by anchoring the metabolic pathway enzymes on protein scaffolds. However, the existing structural scaffolds are introduced and expressed by exogenous plasmids, resulting in the aggravation of cell metabolism burden and the instability of metabolic process. These problems could be solved if we design and build three-dimensional scaffolds with smaller metabolic burden and stabilized production processes by assembling the pathway enzymes. Functional membrane microdomains (FMMs) are the natural scaffolds of bacteria, which serve as a platform for protein aggregation and are rich of various specific proteins, providing a good tool for spatial assembly of enzymes. Therefore, taking Bacillus subtilis synthetic N-acetylglucosamine (GlcNAc) as the research object, the main aim of this project is as follows: First, we will explore the specific mechanisms for the formation and stability of FMMs. Then, we will design and build a space scaffold multi enzyme complex system based on FMMs platform at the plasma membrane for assembling two key enzymes in GlcNAc synthesis to achieve the efficient synthesis of GlcNAc. Taken together, the results of this study will enrich and develop the theory and practice of spatial assembly of microbial metabolic pathways, and provide new ideas and new methods for the construction of microbial cell factories.

空间组织代谢工程将代谢途径酶锚定在蛋白等支架上，构建人工底物通道，减少反应中间物传递壁垒，从而显著提高反应效率，是一种重要的代谢工程研究方法。然而，现有的结构支架均是通过质粒外源引入和表达，细胞代谢负担加重，代谢过程不稳定。而如果利用细胞自身结构类物质，设计和构建代谢负担小、生产过程稳定的三维支架进行途径酶的空间组装则可以解决上述难题。功能膜微域(FMMs)是细菌固有的天然支架，可以作为蛋白聚集的平台，且富含多种特异性蛋白，为途经酶的空间组装提供了良好的工具。因此，本项目拟以枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为对象，探讨FMMs形成与稳定的具体机制，并以FMMs作为平台设计和构建挂靠于质膜上的空间支架-多酶复合体系统，对GlcNAc合成的两个关键酶进行空间组装，实现产物高效合成。该成果将丰富和发展微生物代谢途径空间组装的理论和实践，为构建微生物细胞工厂提供新思路和新方法。

通过空间组织代谢工程将途径酶锚定在蛋白等支架上，构建人工底物通道，能够减少反应中间物传递壁垒，从而显著提高反应效率。在本项目中，我们首先通过可变角度全内反射荧光显微术和单颗粒示踪技术发现，枯草芽孢杆菌细胞膜上的FMMs具有较好的时空稳定性，可以用作组装途径酶的内源性空间支架；揭示了FloA 和 FloT 蛋白中的SPFH结构域负责FMMs的特异性定位，并以寡聚化形式存在，同时还起到稳定FMMs结构的功能；以枯草芽孢杆菌合成GlcNAc为例，通过脚手架蛋白及其特异性结构域-SPFH结构域，将GlcNAc合成所需的途径酶依次锚定在FMMs空间支架上，获取FMMs-多酶复合物系统；之后，结合代谢模型和动力学分析，发现该系统可以形成一条较完整的底物通道，进而增加酶的催化效率，最终显著提高GlcNAc的产量，而且该系统的存在还可以加速物质转运并增强细胞对微环境的适应性；在此基础上，使用工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B对GlcNAc合成的关键酶进行化学计量比调控，获取了一株GlcNAc产量提高3.12倍的重组菌株。此外，进一步对FMMs-多酶复合物系统，特别是FMMs进行了理性的改造，发现通过增加脂质组分和脚手架蛋白能够明显提升FMMs在细胞质膜上的占比，在提升细胞耐受性的同时，可以有效增加途径酶的固定效果，进一步增加产物的合成量。基于上述研究结果，在国际期刊Metabolic Engineering、Biotechnology and Bioengineering等杂志上发表论文5篇；国内期刊中国生物工程杂志、生物工程学报等杂志上发表论文2篇；申请发明专利2件，均已经获得授权。