Bcr/Abl+肿瘤细胞获得性耐药过程中一个新的内质网应激和线粒体相关性凋亡穿梭分子hBex1作用蛋白鉴定

Bcr/Abl异常激活导致慢性髓系白血病（CML）细胞恶性转化和对抗癌剂/凋亡诱导剂不敏感。分子靶向药物Imatinib 是治疗CML最有效的手段，近年来对Imatinib 耐药明显上升，然其获得性耐药机制有待阐明。我们前期研究发现Bcr/Abl+白血病细胞通过沉默hBex1抑制Imatinib诱导凋亡，表达hBex1可激活Calpains，表明hBex1通过内质网应激诱导细胞凋亡，然免疫共沉淀表明hBex1也能与Mcl-1和 Bcl-2结合。提示hBex1是一个新的内质网应激和线粒体相关凋亡穿梭分子。然迄今对hBex1与内质网应激和内源性凋亡分子机制尚不明确。本研究拟在前期研究基础上用酵母双杂交和免疫共沉淀技术筛选和鉴定hBex1下游与内质网应激相关的主要靶分子，分析高表达和沉默hBex1及其靶分子对细胞内质网应激和线粒体相关性凋亡的影响。本研究对阐明肿瘤细胞耐药和凋亡机制有重要意义。

我们前期研究发现Bex1是一个内质网应激和线粒体活化相关凋亡穿梭分子。但迄今对Bex1调控凋亡的分子机制尚不明确。本研究在前期建立的耐Imatinib的K562细胞系及稳定表达Bex1的耐药细胞系基础上，综合运用酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术等方法，从稳定表达Bex1蛋白的耐药细胞系中，筛选出与其相互作用的7个靶蛋白，应用免疫共沉淀技术鉴定了5个下游靶蛋白：Bcl-2、Mcl-1、MPP6、ZNF514、CDH13。我们继续深入研究Bcl-2与Bex1的相互作用及其相互作用导致的生物学功能。采用构建一系列Bex1缺失突变体与Bcl-2相互作用，我们用免疫沉淀技术发现Bex1与Bcl-2的相互作用位点位于Bex1的第33K-64Q肽链。采用激光共聚焦技术分析发现不论Bex1蛋白融合在GFP蛋白的C端或是N端，均有部分Bex1蛋白定位于线粒体，提示Bex1能与Bcl-2共定位于细胞线粒体，而33K-64Q肽链缺失的Bex1则不能定位于线粒体。细胞功能实验发现Bex1过表达后显著增强Imatinib诱导细胞凋亡，而33K-64Q肽链缺失的Bex1诱导细胞凋亡功能明显缺失，但合用ABT-737（Bcl-2小分子抑制剂）后可诱导凋亡，说明Bex1蛋白通过与Bcl-2相互作用诱导细胞凋亡从而逆转耐药。进一步研究还发现Bex1诱导细胞凋亡与其显著抑制Bcl-2蛋白Ser70的磷酸化并拮抗Bcl-2/Bax二聚体形成相关，过表达Bex1蛋白的耐药细胞在Bax敲除后能部分逆转Bex1诱导的细胞凋亡。综上，我们认为Bex1蛋白通过结合Bcl-2活化细胞凋亡通路，从而逆转Imatinib耐药。具体结论包括：1. Bex1能与Bcl-2相互作用，Bex1的结合位点在33K-64Q肽链中；2. Bex1可部分定位于线粒体，缺失33K-64Q肽链的Bex1分子不能定位于线粒体；3. Bex1与Bcl-2结合后抑制Bcl-2的磷酸化及促进Bcl-2与Bex1的解离而促进Imatinib诱导的细胞凋亡。本课题将进一步探索Bex1的蛋白结合域作为开发肿瘤药物增敏剂和耐药逆转剂的可能性。本课题基本按照研究计划进行，经费基本按照原计划使用。目前共培养博士2名，目前均在美国约翰霍普金斯大学交流，硕士3名，已发表SCI论文一篇，核心期刊一篇，另有一篇文章在PLOS one修回中，两篇在审稿中。