pri-miRNA编码的miPEPs在龙眼体胚发生过程中的分子机制研究

As we known, miRNA, which produced from primary miRNA(pri-miRNA), plays an important regulatory role in plant development. pri-miRNA, which until now had been assumed not to encode any proteins. But previous study showed that some pri-miRs encode peptides (miPEPs) that enhance production of their miRNAs. However, its function mining is just the tip of the iceberg. In this project, using the system of longan somatic embryogenesis (SE), based on the previous work, we plan to isolate the full length of pri-miRNAs, to identify their transcription start sites and their promoters, to analyze the potential miPEPs, and the expression patterns of pri-miRNA and miRNA during longan somatic embryo development; to confirm the functions of biological activity of longan pri-miRNA en-coding miPEPs; to study the regulation roles among miPEPs, miRNAs and its targets, to detect how miPEPs effect on the longan somatic embryo morphogenesis. Finally, the molecular mechanism of pri-miRNA encoding-miPEPs during longan SE will be systematically clarified. And these results will further provide scientific evidences for regulating the in vivo and in vitro embryogenesis in longan.

miRNA参与植物生长发育调控的功能已众所周知，其产生依赖于miRNA 初级体primary miRNA(pri-miRNA)的存在。一直以来，pri-miRNA被认为不编码任何蛋白质。最近发现pri-miRNA能编码功能肽(miPEPs)，开辟了基因调控研究的新领域，然而其功能的挖掘只是冰山一角。因此，本研究利用龙眼体胚发生模式系统，进行pri-miRNA全长序列的分离与鉴定，确定其转录起始位点，分析潜在miPEPs，研究pri-miRNA与miRNA在龙眼体胚中的表达规律；确认龙眼pri-miRNA编码的miPEPs具有生物功能活性；研究候选miPEPs对龙眼体胚miRNA及其靶标的调控作用；研究候选miPEPs、miRNA及其靶标对龙眼体胚形态建成的影响，最终确认pri-miRNA编码的miPEPs在龙眼体胚中的作用机制，以期为龙眼体胚发生的分子机制和胚胎发育的调控研究提供参考。

研究发现pri-miRNA能编码短肽（miPEPs）并参与植物的生长发育，但其功能研究还冰山一角。因此，本研究利用龙眼体胚发生模式系统，对24个pri-miRNA进行克隆，共获得16条全长序列，8个pri-miRNA只获得5'UTR。19个pre-miRNA在体胚不同阶段的趋势存在较大差异，在同一发育阶段，由多个miRNA同时参与调控；一个miRNA可能参与多个阶段的调控。不同激素处理下，19个pre-miRNA应答情况存在差异。通过对pri-miRNA预测翻译的smORF，合成12条人工短肽，处理龙眼原生质体或愈伤组织发现，miPEP对于其相应的pri-miRNA所生成的miRNA于miPEP有不同的调控趋势，且对miRNA和pre-miRNA的调控可能是不同步的；miPEP319-2影响龙眼愈伤组织细胞的生长发育和细胞分化，而miPEP166对龙眼体胚形态建成无显著影响。基于遗传转化等技术体系，确认了miPEP具有物种特异性，其对miRNA的表达影响受遗传转化效率、插入位点和基因沉默等因素影响。利用反义寡核苷酸等技术，对miR159a、miR166、miR172a、miR319a、miR390e、miR397a和miR408等7个miRNA进行沉默或过表达，并对其靶基因进行分析，发现miR166a.2对体胚无显著影响，而其余6个miRNA在一定程度上能促进或抑制球形胚形态的建成，揭示了miRNA与靶标在体胚早期中的功能。综上，miPEPs通过影响其对应miRNA的表达水平，进而调控靶基因的表达，最终影响龙眼体胚早期的形态建成。本研究中，我们搭建了miPEPs-miR159/166/319/397/408-靶标在龙眼体胚早期中的调控网络，初步确认了pri-miRNA编码miPEPs在龙眼体胚中的作用机制，为龙眼体胚发生的分子机制的调控研究提供参考。