IgG Fc受体介导病毒感染抗体依赖性增强作用的信号转换分子机制

病毒感染的抗体依赖性增强作用(ADE)在疫病发生和发展过程中发挥重要作用，已成为相关病毒疫苗研发和应用的重要障碍，但其分子机制尚不清楚。本项目以危害严重的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为研究对象，利用表达猪FcγRI/FcRγ的Marc-145转染细胞建立PRRSV FcR-ADE感染模型；以免疫共沉淀和免疫印迹分析PRRSV ADE感染细胞FcγRI/FcRγ的磷酸化程度及其ITAM活化基序对信号分子的募集和活化，以钙离子荧光探针测定细胞钙离子信号强度，分析感染细胞活化状态；通过构建FcRγ ITAM基序的突变体及其募集信号分子的小干扰RNA(siRNA)，分析ITAM基序及募集信号分子对细胞抗病毒反应的调节作用；设计合成ITAM基序及信号分子的小分子多肽，筛选功能性ADE信号调节多肽，探讨IgG Fc受体(FcγR)在介导病毒ADE感染中活化/抑制信号转换的分子基础。

以poFcγRI和γ链共转染Marc-145细胞，经G418 和HygB双抗性筛选和克隆化，构建了poFcγRI/γ链稳定转染细胞株Marc-poFcγRI/γ，玫瑰花环试验和流式细胞仪分析证明其在细胞表面稳定表达poFcγRI，并特异结合猪IgG，但发现poFcγRI/γ共转染Marc-145细胞丧失了对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的易感性，导致PRRSV感染失败。为建立PRRSV的抗体依赖性增强作用(ADE)感染模型，构建了poFcγRIIb稳定转染细胞株Marc-poFcγRIIb，其具有特异结合猪IgG能力，且对PRRSV感染和复制无明显影响。以不同稀释度抗PRRSV抗体与病毒作用后，分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-poFcγRIIb转染细胞，结果亚中和水平抗PRRSV IgG显著增强了PRRSV在Marc-poFcγRIIb和PAM细胞的感染量，并可被抗猪FcγRIIb抗体有效抑制，证明poFcγRIIb能够特异介导PRRSV ADE作用，建立了FcR介导PRRSV ADE感染模型。ADE感染与正常感染的PRRSV感染率在感染后12h 未见明显差异，而感染24h后ADE感染的感染率则显著高于正常感染，提示poFcγRIIb胞内信号传导机制促进了病毒的感染和复制。分别构建了缺失胞内区和突变ITIM 基序的poFcγRIIb突变体，并获得poFcγRIIb突变体稳定转染细胞株Marc-poFcγRIIb-CT和Marc-poFcγRIIb-T。PRRSV ADE感染试验显示poFcγIIb胞内区缺失或ITIM基序突变均导致poFcRIIb介导PRRSV ADE效应丧失，表明poFcγIIb胞内区的ITIM基序在poFcγIIb介导PRRSV ADE效应中发挥关键作用。此外，研究发现PRRSV非结构蛋白nsp1通过TLR和RIG-I信号通路而抑制IFN-β转录，其锌指结构域和176位氨基酸为抑制IFN-β活性所必需；制备了GP5重组蛋白及其单克隆抗体，为PRRSV ADE抗原表位分析奠定基础。在项目执行期间，出版英文译著1部，发表研究论文6篇，其中SCI论文5篇，核心期刊论文1篇；获河南省科学技术进步一等奖和中华农业科技奖优秀创新团队奖各1项；举办全国性学术会议1次，培养硕士研究生4名。