线粒体miRNAs介导公民死亡后捐献供肝能量代谢异常及早期移植物失功的作用研究

Donation after citizen death (DCD) has become the most important source of donors. DCD livers have extremely different ischemia time. To date there is no accurate evaluation index for DCD livers, resulting in a lot of donated organs discarded and the high incidence of graft dysfunction. Mitochondria are the center of energy metabolism in cells, and the earliest changed organelle in the warm ischemia. In previous research, we found that mitochondrial miRNA (mitomiRs) can cause the abnormal energy metabolism in mitochondria, reduce production of ATP, and make cells more sensitive to ischemia. The mitochondrial damage induced by warm ischemia may be due to the role of mitomiRs, and the release of mitomiRs from mitochondria is expected to be an early warning factor for the warm ischemic injury. In this study, we aim to explore the role of mitomiRs in warm ischemia injury and its mechanism and the feasibility of mitomiRs as the evaluation index for quality of DCD liver, to clarify the role of mitomiRs closely related to mitochondrial energy metabolism in hepatic warm ischemia injury of DCD liver, and then to provide a new mean to prevent the early graft dysfunction happening.

公民死亡后器官捐献（DCD）已成为最重要的供器官来源，供者情况复杂且移植物通常经历了长短不一的热缺血时间，目前还没有很可靠的针对DCD供肝本身的评估指标，导致移植物早期失功发生率居高不下；同时，也造成大量捐献器官被舍弃，极为可惜。线粒体是细胞能量代谢中心，也是热缺血最早受累细胞器。前期研究中我们发现线粒体miRNA（mitomiRs）的异常可导致线粒体能量代谢障碍，ATP生成减少，细胞对热缺血更为敏感；而热缺血所致线粒体损伤可能是由于mitomiRs的改变，线粒体崩解后释放的mitomiRs有望成为热缺血损伤的早期预警分子。本研究将探讨mitomiRs在线粒体热缺血损伤中的作用及其机制，探讨将mitomiRs作为DCD供肝质量评估指标的可行性；进而明确线粒体能量代谢密切相关mitomiRs在DCD供肝热缺血损伤中的作用，为改善移植物早期失功提供新的思路。

DCD肝脏的热缺血损伤（Isechemia-Reperfusion Injury，IRI）程度是影响肝移植受体预后的独立危险因素。在现行供肝获取标准下，基本已经对除隐匿性缺血损伤外的大部分危险因素给予有效控制。但是正是由于DCD供肝缺血损伤具有隐匿性的特点，造成了如今难以通过已知指标准确的评价DCD供肝质量的现状。我们的研究主要将在保证系统性寻找的同时，尽可能的深度挖掘可用于DCD供肝IRI判定的分子生物学标志物。.本研究通过肝脏热缺血基础数据、全转录组测序和透射电镜观察将早期肝脏IRI聚焦于线粒体改变。细胞层面全转录组测序，结合线粒体层面miRNA芯片定量和RT-qPCR定量找到了多种潜在的新型生物标志物，结合生物信息学分析最终在我们的研究数据中，miR-23b-5p被认为是一种最佳的早期肝脏缺血损伤标志物。随后的研究中，我们以活体细胞内原位杂交方式证明了miR-23b-5p是一种mitomiR，而体外细胞1%低氧培养的功能学检测中证明了miR-23b-5p的表达水平与缺氧时间正相关。在临床数据中证明了miR-23b-5p是一种有效的对DCD供肝质量判定的生物标志物。.在功能学研究中，体外研究证明了在1%低氧状态下，下调miR-23b-5p将增加其细胞凋亡水平，而主要影响的凋亡相关分子是Bcl-2。为更为准确的验证，我们进行了体内研究，采用野生小鼠AAV下调miR-23b-5p和AAV-CRE-Loxp Dicer-/-小鼠回输成熟体的miR-23b-5p两种方式分别观察肝脏组织IRI，进一步明确了miR-23b-5p上调存在抑制凋亡的作用。无论是在野生型还是转基因小鼠中miR-23b-5p主要是通过凋亡相关分子Bcl-2影响凋亡。.机制研究中，通过miR-23b-5p上调和下调人工具细胞293T，检测其转录组改变。进一步发现下调miR-23b-5p将提高线粒体呼吸链各复合体相关基因的表达，同时提高线粒体内mt-RNR1（12s）、mt-RNR2（16s）表达水平而过表达将抑制其相关基因表达和降低mt-RNR1、mt-RNR2表达水平，结合现有文献报道，我们认为低氧伴线粒体的呼吸能力上调可能是显著增加再灌注损伤主要原因。Seahorse 线粒体呼吸功能检测证实了上调miR-23b-5p抑制ATP生成下调线粒体呼吸能力，而下调miR-23b-5p将增加线粒体最大呼吸