倭蜂猴肠道微生物宏基因组文库构建及水解酶功能基因筛选

倭蜂猴是国家I类重点保护野生动物，我国仅见于云南东南部，其肠道中存在的微生物群落是长期进化的结果，与动物的食性、机体免疫、营养需求等有密切关系。由于倭蜂猴食性较杂，摄食种类广泛的植物和动物性食物，因此其肠道微生物中可能蕴涵着大量潜在的水解酶基因资源。本项目的目的是以倭蜂猴肠道微生物为研究对象，首先应用分子生态学方法研究倭蜂猴肠道微生物群落的结构组成，分析其微生物的遗传多样性，为进一步了解倭蜂猴肠道微生物之间及与宿主之间的关系、促进该野生动物的保护及其肠道微生物的利用奠定基础；其次，构建倭蜂猴肠道微生物宏基因组文库，从中筛选潜在的水解酶类功能基因，以进一步挖掘倭蜂猴肠道微生物酶基因资源库，为后续开发有工业应用价值的新型酶、探索倭蜂猴肠道微生物新基因的研究和利用奠定基础。

倭蜂猴是国家I类重点保护野生动物，其胃肠道中存在的微生物群落是宿主长期进化的结果，与动物的食性、机体免疫、营养需求等有密切关系。本项目采用宏基因组技术，首次对倭蜂猴胃肠道微生物进行了以下研究。1、通过宏基因组直接测序全面研究了倭蜂猴胃肠道微生物群落的结构组成：研究表明，与人类和其它动物相似，倭蜂猴胃肠道微生物中Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes占优势，然而其所占相对比例不同。属的水平上，Bacteroides的细菌最丰富，其中大部分是B. fragilis。特别的是，倭蜂猴粪便样本比人类和其他动物含有更多疣微菌门的细菌。古菌、真菌和病毒是倭蜂猴粪便微生物组的次要组成成分，所有古菌都归属于Euryarchaeota和Crenarchaeota，其中产甲烷古菌最为丰富和多样。倭蜂猴粪便微生物组中共存在Ascomycota、Basidiomycota 和Microsporidia三个门的真菌。2、对倭蜂猴、人、狗、鼠、鸡和牛的胃肠道微生物进行了比较宏基因组研究：系统发育水平的层次聚类表明，倭蜂猴与人类及其它动物分开，但却和鼠的宏基因组聚在一起。尽管倭蜂猴和鼠胃肠道微生物的群落结构相似，但其功能却有差异，代谢水平的层次聚类发现，倭蜂猴、人、鸡和狗聚在一起，而鼠、牛与倭蜂猴最不相似。同时，比较宏基因组分析在倭蜂猴的胃肠道微生物组中发现了相对高丰度和多样性的芳香族化合物代谢系统。3、构建了倭蜂猴胃肠道微生物宏基因组fosmid文库，并通过功能筛选从中筛选潜在的水解酶类功能基因：研究获得了一个新的淀粉酶基因plA1，其ORF全长为1539 bp，预期编码的蛋白质由512个氨基酸组成，预计分子量为55.439 kDa。系统进化分析表明，plA1属于GH13_28亚族的α-淀粉酶。该酶的最适反应pH为6.5，最适反应温度为50℃。. 上述研究结果丰富了目前有限的灵长类动物胃肠道微生物宏基因组研究，为人类与非人灵长类动物间的比较宏基因组分析以及人类与其微生物组进化的比较研究提供了框架；同时，为进一步挖掘倭蜂猴胃肠道微生物酶基因资源库，开发有工业应用价值的新型酶奠定了基础。