基于肝靶向性转运机制的阿德福韦单L-氨基酸酯，单胆酸酯衍生物的设计、合成与生物活性研究

The unsatisfactory therapeutic effect of nucleoside or nucleotide anti-HBV agents for treatment of viral hepatitis disease has been attributed to its insufficient enrichment in hepatocyte and poor liver-targeted location. Preliminary studies on adefovir derivatives revealed that adefovir bis(L-amino acid)ester prodrugs and mono L-amino (thio)acid ester, mono NSAID carboxylic ester prodrugs had more potent anti HBV activity, selective index (SI)and lower renal cell toxicity compared with adefovir dipivoxil. Based on these results, in this project we will use adefovir bis(L-amino acid)ester prodrugs as lead compounds, according to pharmacology and pharmacokinetics study found that bile acid prodrug strategy can improve drug oral bioavaliability and liver-targeted enrichment by using enterohepatic circulation and liver -targeted transportation mechanism of bile acid mediated by transporters in the liver cell surface and brush border membrane of the terminal ileum epithelial cells adopt the principle of hybridization to introducing both L-amino acid ester and bile acid ester fragments on the phosphonate functionality of adefovir,to design and synthesis adefovir mono L-amino acid ester, mono bile acid ester derivatives. HepG2 2.2.15 cells model, mouse primary hepatocytes model, Caco-2 cell assay model and mouse liver-targeted study model will be used as in vitro and in vivo pharmacodynamics and absorption behavior evaluation approaches respectively. Innovation in this project is to apply mono L-amino acid ester,mono bile acid ester liver-targeted prodrug design strategy as breakthrough for improving live-targeted location and oral bioavailability of adefovir dipivoxil in clinical applications, so as to lay the bases for the theory and practice for creating novel anti-HBV adefovir prodrug.

核苷(核酸)类抗HBV药物临床应用中存在不良反应的主要原因是药物在肝细胞中选择性富集差，肝细胞靶向定位能力弱。本项目拟在前期获得的具有较好抗HBV活性、较高作用选择性的阿德福韦双L-氨基酸酯衍生物基础上，进一步以其为先导化合物，根据胆酸酯前药修饰策略能明显提高被修饰药物肝靶向性富集能力与口服生物利用度研究结果，采用拼合设计原理在先导化合物结构中膦酸基上同时引入L-氨基酸酯与胆酸酯结构片段，设计、合成阿德福韦单L-氨基酸酯，单胆酸酯衍生物。分别采用HepG2 2.2.15细胞株抗病毒模型，原代小鼠肝细胞摄取模型，Caco-2细胞吸收潜性模型以及小鼠体内肝靶向性评价模型进行目标化合物抗病毒活性，肝细胞摄取特性，口服吸收潜性以及体内肝靶向性行为评价。本项目创新点是将单L-氨基酸酯，单胆酸酯前药设计策略作为解决阿德福韦酯临床应用中存在的肝靶向性定位能力弱与口服吸收生物利用度低这两个不足的突破口。

在国家自然科学基金（No. 81460523）的大力支持下，本项目组根据胆汁酸能够借助于肝细胞表面的钠离子-牛磺胆酸转运多肽（NTCP）介导的主动转运机理提高药物被肝脏吸收能力的特性，以阿德福韦双L-氨基酸酯为先导化合物，将胆酸酯结构片段引入目标化合物结果中，设计、合成了32个未见文献报道的阿德福韦单L-氨基酸酯，单胆酸酯衍生物。对获得的目标化合物采用1H /13C NMR, ESI-MS与ESI-HRMS 等手段进行了结构确证。课题组分别采用 HepG2 2.2.15 细胞株抗病毒模型进行了目标化合物抗HBV活性研究；采用原代小鼠肝细胞摄取模型考察了目标化合物原代肝细胞摄取特性，采用pEGFP-NTCP稳定转染的HEK293细胞模型考察目标化合物摄取机制；采用HK-2细胞模型考察目标化合物肾细胞毒性，并利用hOAT1稳定转染的HEK293细胞模型进行了其肾毒性产生机制研究；利用人工胃液、人工肠液、大鼠空白血浆和大鼠肝微粒体进行体外共孵育模型，阐明了目标化合物的体外代谢机制；采用小鼠体内分布实验考察了目标化合物在动物各脏器中分布水平，阐明其肝靶向性分布特点；最后采用大鼠口服灌胃方法进行了目标化合物的药代动力学研究，获得了目标化合物的药代动力学参数。结果发现3个化合物具有较阳性对照阿德福韦酯更好的抗病毒活性，并总结出其构效关系；目标化合物原代肝细胞与NTCP转染细胞摄取能力明显高于阳性对照，体内外代谢机制研究表明，目标化合物在不同环境中均能够降解产生原型药物阿德福韦，同时目标化合物具有明显的肝靶向性分布特征，其动物体内半衰期与药时曲线下面积（AUC）均明显优于阳性对照。肾细胞毒性研究表明目标化合物HK-2肾细胞毒性明显低于阳性对照，机制研究结果提示目标化合物并非肾小管上皮细胞上hOAT1的特异性底物，因此其在转染与非转染细胞中毒性未见明显差异。通过项目实施（1）申请专利1项：具有肝靶向性转运特性的阿德福韦单硫代L-氨基酸酯、单胆酸酯衍生物、其制备方法与评价专利申请号：201610427712.0；（2）在SCI收录期刊《Medicinal Chemistry Research》以及核心期刊《中国药理学通报》,《中国医药工业杂志》等发表研究论文11篇；完成硕士研研究生论文3篇；（3）项目执行中培养研究生3人。综上本项目完成了申请书中要求的各项研究工作，达到结题验收标准。