E2型短指症新致病基因FOSL2的鉴定与功能研究

Brachydactyly ("short digits") is a general term that refers to disproportionately short fingers and toes, and forms part of the group of limb malformations characterized by bone dysostosis. Although the various types of brachydactylies, the common pathogenesis is the dysregulation of proliferation and/or differentiation of chondrocytes. However, the genetic cause of many cases of brachydactylies remains unexplained. We used an exome-sequencing strategy and identified a pathogenic FOSL2 mutation (V102M) in a girl and her mother with brachydactyly type E2 (BDE2). In our previous study, we found that FOSL2-V102M leaded to suppression of proliferation and differentiation of chondrocytes compared with wide type FOSL2. Therefore, we intend to use in vitro experiments and transgenic mouse model to identify FOSL2 as a novel causative gene of BDE2 and clarify the exact molecular mechanism of the FOSL2-V102M mutation in the pathogenesis of BDE2.

短指症是一类以短指畸形为主要特征的骨骼发育障碍疾病。最新的命名与分类标准将短指症分为A-E五种主要类型。尽管分型众多，它们都有一个共同的发病机制：软骨增殖和/或分化障碍，多种基因可通过影响软骨增殖分化导致短指症的发生。然而，很多短指症患者的致病基因仍不清楚。我们前期在临床上发现一个E2型短指症家系，对患病母女二人全外显子组测序并进行生物信息学分析后获得重大发现：FOSL2基因杂合错义突变c.304G>A（p.V102M）为可能的致病突变位点。前期细胞预实验亦证实FOSL2-V102M突变导致软骨细胞增殖分化障碍；同时我们已建立FOSL2-V102M转基因小鼠。基于上述研究基础，本项目拟通过体外细胞实验和转基因小鼠模型的整体实验，确定FOSL2是E2型短指症的新致病基因，并阐明FOSL2-V102M突变导致E2型短指症发病的分子机制。

单基因遗传性疾病的研究极大地丰富了人们对致病基因功能和疾病发病机制的认识。因此，对遗传性单基因骨病的研究，尤其是鉴定新的致病基因及后续的功能研究，是近年骨骼研究领域的一大热点。我们在临床上诊断了一个E2型短指症家系，全基因组外显子测序发现 FOSL2基因V102M突变为可能的致病突变位点。我们利用前软骨细胞系ATDC5进行了转染实验，并进行了MTT及细胞计数检测。我们进一步构建了带Myc标签的FOSL2野生型V102M突变型的过表达质粒，通过在RCS细胞中进行外源PTHLH promoter-luciferase实验，证实了FOSL2基因V102M突变对PTHLH表达的影响。同时，我们培育了FOSL2转基因小鼠，通过观察小鼠一般情况及Micro CT检测，测量1周、2周、4周、8周、16周转基因小鼠和正常对照小鼠其身长、体重、骨密度、骨结构等，结果发现转基因小鼠出现侏儒表型。全骨架染色发现转基因小鼠软骨生长发育障碍。本研究通过体外细胞实验和小鼠实验证实了FOSL2基因V102M突变通过与PTHLH启动子结合来下调PTHLH基因表达，从而导致了软骨发育障碍及生长迟缓。..本课题计划做了部分调整。我们收集了一个X连锁3型腓骨肌萎缩症大家系。该家系共四代34名家庭成员，其中8人患病，临床表现为肢体远端骨骼畸形与肌萎缩。我们利用Illumina SNP 芯片完成对了该家系的连锁分析，结果发现chrX：122441479-142523882染色体区域均有LOD值达到3左右，支持连锁。我们对该家系进行了低覆盖全基因组测序，结果发现在Chr X:132555646-132635565（hg19）区域出现了明显的基因片段缺失。我们对Chr X Del区域家系进行了共分离检测，结果发现缺失区域符合家系分离现象。同时，我们对100个正常男性个体对Chr X Del区域进行筛查，结果在100个样品中未发现该检测区域的缺失。随后，我们利用PCR进一步明确了该缺失区域的断点，确定缺失位置信息为NCBI37/hg19 Chr X:132562988-132619064 Strand: +。这一缺失片段的发现代表了CMT一种新的发病机制。我们的发现强调了在CMT病因研究中未能发现致病基因时应考虑非编码区缺失的重要性。