原虫模式生物布氏锥虫mRNA 3'-末端加工装置的组成及其功能的系统分析

Trypanosomes are evolutionarily ancient protozoan parasites with important biology and medicine significance. That the unusual aspects of the genes arranged into polycistronic transcription units and no conserved polyadenylation signal (PAS) identified in the 3'-UTR suggested the pre-mRNA 3'-end processing should be distinct in the trypanosomes from other eukaryotic organisms, however, the process and mechanisms remain elusive. Previous studies showed that there are some conserved cleavage and polyadenylation factors found in Trypanosome brucei, and some trypanosome-specific factors involved in the 3'-end processing were also identified in our lab. This project is aiming at exploring the composition and function of the pre-mRNA 3'-end processing machinery in Trypanosoma brucei by a series of biochemical and genetics analysis, including: to identify the components of the cleavage/polyadenylation complex and the accessory factors by affinity purification combined with mass spectra and RNAi library screening; to estimate the function of the identified 3'-end processing machinery factors on the target mRNA processing through RNAi experiments; to get the information on the structural organization of mRNA 3'-end processing machinery by studying the protein-protein interaction; to map the possible PAS sequences by RNA tagging, photoavtivable in vivo cross-linking and immunoprecipitation, and to characterize the target sequence by bioinformatics assay. The results are expected to facilitate the elucidation of the mRNA 3'-end forming process and the molecular mechanism, and help to uncover the most conserved processing parts in the evolutionary of eukaryotic organisms.

单细胞寄生性原虫锥虫具有重要的生物学和医学研究意义。独特的多顺反子转录以及不含任何保守的多聚腺苷化信号等特征暗示着锥虫pre-mRNA 3'-端的加工机制将显著不同于其它真核生物，但相关信息甚少。已知锥虫含有一些保守的剪切/多聚腺苷化因子，我们的前期工作则鉴定出一些锥虫特异的多聚腺苷化因子。本项目将采用多种生化和遗传学手段对锥虫mRNA 3'-端加工装置的组成及其功能进行分析，包括：利用亲和纯化合并质谱、RNAi文库筛选等全面鉴定剪切/多聚腺苷化因子和相关的辅助因子；借助RANi特异性敲低对RNA加工的影响来分析各蛋白因子的功能；研究蛋白间相互作用来获取复合物的结构组成；通过RNA 标签、体内交联技术以及生物信息学分析来确定多聚腺苷化信号序列。预期研究结果不但会揭示锥虫mRNA 3'-末端的加工过程和机制，而且有助于揭示该过程在真核细胞进化过程中的核心保守部分。

布氏锥虫是医学和生物学上重要的寄生性原虫，能够引起严重的人类非洲睡眠病和家畜的Nagana病，其独特的基因组结构特征和基因表达特点使其成为研究转录后调控的原虫模式生物。mRNA 3’-端多聚腺苷化是多数真核mRNAs成熟的必需过程，但在原生生物中所知甚少。本项目主要对布氏锥虫mRNA的3’-端加工装置进行组成和功能上的分析。通过串联亲和纯化合并质谱（TAP/MS）对mRNA 3’-末端剪切/多聚腺苷化复合物的蛋白组成进行了鉴定；通过RNAi分析了该复合物核心蛋白表达沉默后对成熟mRNA生成的影响；通过酵母双杂交、密度梯度离心、RNAi合并TAP/MS技术对复合物结构进行了初步分析。本项目通过实验证实了CPSF160、CPSF100、CPSF73、CPSF30、Fip1和CstF50六种核心组分是锥虫和其它广泛研究的真核生物所共有的，提示这些组分所发挥的功能是mRNA 3’-端加工过程进化中最为保守的部分；同时鉴定出三种锥虫特异的剪切/多聚腺苷化复合物核心组分CPC159、CPC30和CPC15，为锥虫mRNA 3’-末端加工过程不同于其它真核生物之处提供了结构基础。RNAi干扰实验表明这些鉴定出来的核心组分不但是细胞生长必需的，而且对tubulin pre-mRNA的剪接及成熟mRNA的稳定存在是必需的，说明剪切/多聚腺苷化复合物参与到多顺反子的剪接过程。重要的是，我们通过检测tubublin mRNA和蛋白水平以及报告基因检测，发现CPSF73对翻译具有负调控作用，质谱鉴定结果分析提示剪切/多聚腺苷化复合物可能通过与翻译起始因子相互作用而对翻译进行调控，这是一个全新的调控机制，为细胞不同生化过程存在广泛的互作网络提供了证据。本项目初步构建了锥虫剪切/多聚腺苷化复合物不同组分间的蛋白互作图谱，证明了CPSF73、CPSF160和CPC159是复合物完整性必需的，同时还表明不同蛋白组分间亲和力不同而形成了不同的亚复合物。总之，上述数据初步解析了锥虫剪切/多聚腺苷化复合物的结构及功能，除文章还未发表外，顺利地完成了本项目设定的各项研究目标，为揭示锥虫mRNA 3’-端加工机制奠定了基础，不但有助于揭示基本生命过程的多样性，而且为抗锥虫治疗提供了可能的新治疗靶位。