施氏假单胞菌中新型NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶研究

已报道的NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶（L-iLDH）均以FMN为辅因子，在某些微生物L-乳酸代谢及致病过程中起重要作用。申请者基于多种微生物的比较基因组学分析与前期实验结果，推断施氏假单胞菌A1501中由lldA、lldB和lldC三个基因构成的基因簇lldABC编码一种新型多亚基蛋白，以Fe-S中心为辅因子，行使催化L-乳酸生成丙酮酸的功能。该蛋白与目前已报道的L-iLDH具有明显区别，为一种新型L-iLDH。本申请以施氏假单胞菌A1501为研究对象，克隆获得基因簇lldABC，基因敲除手段确定lldABC在施氏假单胞菌A1501 L-乳酸代谢中的关键作用；外源表达并分离纯化该新型L-iLDH，研究其基本酶学性质；生物信息学与生化分析相结合确定亚基LldA、LldB和LldC在L-iLDH催化氧化L-乳酸过程中的作用；分析该新型L-iLDH获取、传递电子过程，阐明其催化机理。

NAD-非依赖性L-乳酸脱氢酶(L-iLDH)在微生物L-乳酸代谢及致病过程中起重要作用。已报道的L-iLDH均为同型多聚体蛋白，以FMN为辅因子。项目组基于比较基因组学分析，推测Pseudomonas stutzeri A1501中基因簇lldABC编码一种异型多聚体蛋白LldABC，以Fe-S簇为辅因子，行使催化L-乳酸生成丙酮酸的L-iLDH功能。.P. stutzeri A1501中LldABC为膜蛋白，外源表达与分离纯化困难，项目组克隆获得lldABC，通过系统的条件优化，成功实现lldABC的外源表达，检测到L-iLDH活性；采用硫酸铵沉淀、离子交换、亲和层析等手段，得到的目的蛋白经SDS-PAGE及MALDI-TOF检测，三条条带分别与LldA、LldB和LldC相符；结合凝胶过滤色谱确定LldABC中LldA、LldB和LldC间比例为1:1:1；对LldABC的基本酶学性质及稳态动力学机制进行分析，确定LldABC催化反应遵循乒乓机制。.基因敲除、回补及酶活测定相结合，证实LldABC在菌株L-乳酸代谢中起关键作用，确定了LldABC的体内功能。lldA、lldB和lldC的敲除均会导致菌株L-乳酸代谢能力丧失，而克隆表达LldAB、LldAC和LldBC，均未检测到L-iLDH活力，证实LldA、LldB和LldC对L-iLDH功能缺一不可。吸收光谱及元素分析表明LldABC中不存在黄素辅因子，仅存在Fe-S簇，且L-乳酸脱氢过程中Fe-S簇氧化还原状态发生改变，而对LldA、LldB中Fe-S簇结合位点定点突变后LldABC的酶活明显降低。综合生物信息学、酶学以及定点突变结果，推测LldABC催化L-乳酸脱氢的机理：LldA与乙醇酸氧化酶具有同源性，以Fe-S簇为活性中心，催化L-乳酸生成丙酮酸；LldB亚基通过Fe-S簇将LldA产生的电子传递至外源电子受体；而LldC通过自身膜整合区及亚基间相互作用，将LldABC锚定于细胞膜上；三者相互配合完成催化L-乳酸脱氢同时提供电子给电子传递链产生能量的生物学功能。.本项目揭示了LldABC在P. stutzeriA1501 L-乳酸代谢过程中的具体作用，首次对该新型L-iLDH的生物学功能、生化性质与催化机理进行了系统研究；研究结果对深刻了解微生物L-乳酸代谢机制及后续致病机理分析具有重要理论意义