microRNA调控精原干细胞移植后归巢和克隆增殖机理的研究

本项目拟将精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）移植受体小鼠睾丸曲细精管后,利用芯片分析支持细胞和SSCs的miRNA和mRNA表达谱，筛选与SSCs与支持细胞粘附相关和与SSCs克隆增殖相关的miRNA；利用体外SSCs和支持细胞共培养系统，通过miRNA对靶基因和有关信号通路中基因表达调控的研究，探讨关键miRNA参与调控SSCs -支持细胞之间相互作用以及SSCs克隆增殖的机制；利用慢病毒感染SSCs获得特异miRNA过表达（或下调表达）转基因SSCs,同时，通过慢病毒显微注射入曲细精管，建立特异miRNA过表达（或下调表达）无内源SSCs的小鼠睾丸模型，进行SSCs移植，进一步验证关键的miRNA在体内对SSCs移植后在微环境中克隆增殖的影响。为SSCs的移植曲细精管后归巢和增殖以及最终获得生精功能的研究提供基础资料。

本项目通过精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）移植后,利用芯片分别分析支持细胞和SSCs的miRNA和基因表达谱，筛选与SSCs与支持细胞相关和SSCs克隆增殖相关的miRNA；确定了miR-10a和miR-29a,b1两个microRNAs为研究对象，构建完成floxp-stop-floxp-miR-29a,b1以及floxp-stop-floxp-miR-10a转基因小鼠；分别获得了生殖细胞条件过表达vas-cre-miR-10a和vasa-cre-miR-29a,b1小鼠和支持细胞过表达Amh-cre-miR-10a和Amh-cre-miR-29a,b1小鼠。完成了四个转基因小鼠的表型分析。结果发现生殖细胞过表达miR-29a,b1或miR-10a小鼠发生生殖障碍，成年小鼠精子发生障碍。进一步解释了生殖细胞过表达miR-10a小鼠生殖障碍可能与早期精原干细胞与支持细胞之间的极性连接损伤和调控减数分裂相关基因Rad51的表达下调有关。体外分析过表达miR-29a,b1小鼠支持细胞培养特性，同时与精原干细胞共培养，结果显示过表达miR-29a,b1支持细胞不影响SSCs的克隆形成与增殖。进一步研究显示，过表达miR-29a,b1支持细胞通过产生exosomes富集过量miR-29a,b1选择性进入SSCs，抑制了microRANs对SSCs干细胞的影响。同时，揭示了小鼠SSCs 中 H3K9me3 的分布以及甲基化酶ESET通过SSCs 组蛋白 H3K9me3促进小鼠SSCs的增殖与分化。.在本项目的资助下，完成项目预期的研究任务。构建精原干细胞和支持细胞分离培养以及小鼠输出小管移植的方法和平台；分析精原干细胞移植后归巢克隆区域的基因芯片和microRNAs分析，筛选对精原干细胞增殖分化的影响的主要miR-10a和miR-29a,b1；构建条件过表达miR-10a和miR-29a,b1小鼠模型，证明生殖细胞过表达miR-29a,b1或miR-10a小鼠发生生殖障碍，支持细胞过表达miR-29a,b1生殖正常可能调控机制；揭示甲基化酶ESET通过SSCs 中组蛋白 H3K9me3调控小鼠SSCs的增殖与分化。发表论文3篇，还有一些重要结果目前仍在整理与论文撰写；培养博士研究生2名；培养硕士研究生4名。