中药多糖的免疫调节剂的树突状细胞筛选及其内吞机制的研究

Polysaccharides extracted from some of the traditional Chinese medical herbs are critical components in Chinese medicine, which targets to dendritic cells (DC) and modulate the innate immune system, therefore exerting its anti-tumor and anti-virus function.Upon the first DC vaccine approval by FDA in 2010, the in vitro induction and culture of DC, followed by the clinical trials have been emphasized and pushed forward rapidly. However, the mechanisms for these polysaccharides that can enter into the cells, stimulate the maturation and functionalization of DC, together with suitable cell models to screen the function of polysaccharide, have not been investigated systemically. Through spleen-derived DC, peripheral blood mononuclear cell derived and differentiated DC, bone marrow derived and differentiated DC, and cell line derived DC, the effects of polysaccharide on the differentiation/maturation/function of DC and associated mechanisms for cellular uptake followed by the intracellular process of the polysaccharide, will be studied. In addition, we will engineer cell line to stably express a luciferase marker gene under control of IL-1beta promoter to analyze the influence of polysaccharides on expression of inflammatory factors. Based on the DC models for screening components with improved immune response activities, we will gain further insight into the diversity of immune responses by variable polysaccharides from Chinese medical herbs and associated cellular uptake and process, therefore provids an efficient screening method for screening immune response modulators from Chinese medicine.

中药多糖是传统中药的关键成份之一，其可作用于树突状细胞 (Dendritic Cells, DC) 调节初始免疫应答，发挥其免疫调节，抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用。自2010年首个DC肿瘤疫苗被FDA批准以来，DC体外培养与药物诱导以及临床治疗的研究发展迅速。中药多糖类物质在细胞内的内吞与成熟机制以及多糖相关的功能筛选平台，还鲜有系统研究。本研究建立多种DC培养平台，包括脾细胞源、周边血单核细胞和骨髓细胞源并分化的、细胞系源并分化的DC，研究多糖对树突状细胞的分化、成熟及功能的影响，及中药多糖在细胞中的内吞机制。另外，构建以IL-1beta 为启动子带有报告基因的稳定细胞株，分析中药多糖对炎症因子表达的影响。通过可筛选具有免疫活性的药物的树突状细胞模型，可直接深入了解不同中药多糖的免疫活性差异，及其在DC中的内吞机制与剪切过程，由此进一步求证中药免疫调节剂的作用机制，提供一个高效筛选平台。

中药多糖是传统中药的关键成份之一，其可作用于调节抗原呈递细胞的初始免疫应答，发挥其免疫调节等功能。我们从灵芝、香菇、黄芪、海藻、麦冬中提取、纯化及表征了五种中药多糖，并且发现其低盐洗脱下来的多糖组分的分子量大多在10-15KDa，并含有多种单糖组分，其免疫刺激能力远远优于水洗脱组分。通过对巨噬细胞表面抗原簇MHCII/CD40/CD80/CD86表达量、吞噬能力/NO分泌/酸性磷酸酶活性的变化的研究，我们发现灵芝多糖的对巨噬细胞免疫激活能力优于其它多糖，而麦冬多糖效果最差。我们还运用了高内涵成像与分析系统，对多糖导致巨噬细胞伪足生长导致的细胞不规则度进行了定量，指出这个参数可以用来快速评价中药多糖的免疫刺激能力。另外，我们成功建立了树突状细胞（Dendritic Cells, DC)分化及功能评价系统，我们发现五种中药多糖对DC的的免疫刺激能力各异。在此基础上，我们对灵芝多糖进行了荧光标记，追踪了其内吞过程，并且利用内吞抑制剂研究了多糖内吞与DC成熟的关系。曾经认为，多糖刺激DC的成熟一般依赖于其与细胞表面的Toll like receptor的接触，我们的研究发现，DC的成熟也与灵芝多糖的内吞有一定关系。最后，我们将多糖进行了纳米化处理，合成了金多糖纳米颗粒，我们发现其能显著促进DC表面抗原簇的表达、降低DC吞噬能力和酸性磷酸酯酶的活性，刺激DC对CD4+和CD8+细胞的体外及体内的增殖，最终可以更好的抑制荷瘤的形成。因此，我们的研究提供了两种优越的体外平台，即利用巨噬细胞的不规则度以、DC的成熟度来评价中药多糖的免疫激活效果，也发现了多糖刺激DC成熟还依赖于其内吞，最后延展性的发现多糖的纳米化颗粒能让其抗肿瘤效果更好，其有可能是基于多糖颗粒在免疫系统如脾脏/淋巴以及肿瘤中的富集效应导致。