B糖基转移酶无序环中氨基酸置换对B血型抗原表达影响的研究

人类ABO(H)血型抗原由特异性的糖基转移酶合成。糖基转移酶（GT）功能的异常可导致A或B抗原表达减弱，形成ABO亚型。对GT突变体的研究是我们了解GT相关位点功能的有效途径。本课题将对申请者国际首先发现的位于酶无序环中的2个B酶突变体GTB W181R和GTB V184M进行分子机制研究。血型血清学方法分析个体表型；SWISS-MODEL软件构建三维分子模型；定点突变法构建突变体pCWΔlac载体原核表达GT蛋白，检测催化常数（Kcat）和米氏常数（Km）；构建突变体pcDNA3.1载体转染HeLa 和K562细胞，采用流式细胞术检测细胞表面B抗原表达量的变化，采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜检查研究突变GTB在真核细胞内的转运和定位。从血清学表型、拓扑学、动力学和细胞生物学4个角度研究GTB无序环氨基酸置换对酶以及B抗原表达的影响，为研究糖基转移酶功能与结构的关系提供依据。

血清学研究揭示了2例非常罕见的Bx个体的血型表型。在血清酶活性测定中，B型对照组检出明显的B酶活性（滴度为64），而Bx亚型个体几乎未能检出血清B酶活性(滴度为0)。根据晶体结构分析， W181和V184均暴露于酶-底物结合的表面，同时均是酶与供体UDP-Gal的UDP部分相互作用的位点，氨基酸置换W181和V184改变了酶活性中心的局部构象，减弱了酶的活性。采用定点突变的方法，成功构建W181R和 V184M野生型和突变体pCWΔ lac原核和pcDNA3.1真核表达载体。原核表达纯化蛋白的酶活性初步检测显示，突变蛋白与野生型蛋白相比，活性明显下降。真核载体转染K562细胞，并采用流式细胞术检测Bx抗原表达量。初步流式结果显示，Bx突变体V184M和W181R的MFI 值明显低于野生型。初步免疫荧光染色和突变GTB的亚细胞定位实验结果显示，野生型GTB蛋白除在ER内分布外，在Golgi体内也大量存在；V184M和W181R突变GTB蛋白主要分布于内质网。进一步的实验正在进行中。在研究ABO基因变异541T>C和 550G>A导致ABO变异表型的潜在生物学机制的同时，我们共检出了29种ABO亚型新等位基因，并对其中部分等位基因进行了分子遗传学分析和分子机制研究。在这些新等位基因中，有1个缺失突变的等位基因，4个杂交等位基因，24个点突变等位基因。大多数等位基因存在于6-7外显子区域，其他存在与1-5外显子及剪切区域。我们发现一个ABO启动子突变, -35_-18del，并用双荧光分析的方法证实该突变引起启动子活性下降。我们还发现2个携带5'端提前终止密码子E3X和R18X的点突变7G>T和52C>T，这2个突变与极弱ABO亚型“Ael”和“Bel”相关。我们的研究为ABO启动子异常参与ABO弱表现型的形成提供了第一手证据。我们还首次描述了自然发生的带有5'端提前终止密码子的ABO等位基因可导致Ael和Bel表型。