基于量子点发光探针研究抗逆植物激素细胞信号转导

抗逆性植物激素能提高植物对逆境抵抗和忍耐能力，研究其作用机理对指导和提高农业生产有重要作用。. 本项目创新地合成光谱可调谐的抗逆激素受体、细胞钙离子的量子点发光探针，建立植物细胞中信号转导研究新方法。在离子液体中合成易分离纯化的量子点，通过控制反应条件和对表面进行修饰获得发光性能优良、具有生物相容性、光谱可调谐的量子点。将抗逆植物激素脱落酸、茉莉酸和能选择性识别钙离子有机分子组装到量子点表面形成量子点发光探针。选择绿豆下胚轴和烟叶幼苗原生质体或质膜为实验体系，利用合成的探针对激素受体、细胞钙离子进行识别，用荧光法研究植物激素与受体的结合位点，表征细胞中受体的动态分布和活性，用统计分析的方法确定结合位点的特异性，通过分析第二信使钙离子的浓度获取信号转导的信息，对多重标记的细胞进行分析。

抗逆植物激素能提高植物对逆境抵抗能力，对提高农业生产有重要作用。但长期以来人们一直不清楚激素的作用机理，原因是植物体系的组成及激素作用机理都十分复杂，缺乏灵敏度高、选择性好、简便易行的分析表征手段。. 为了解决上述问题，本项目基于量子点光照下能稳定发光，激素和激素受体蛋白能特异性结合的特点，合成和表征了具有选择性识别功能的茉莉酸、水杨酸、丁酰肼3个激素受体探针，1个信号转导第二信使细胞钙离子探针。建立了原位检测植物组织中激素结合位点的方法，对激素受体在植物组织中的空间分布进行可视化表征。利用细胞钙离子探针建立了受激素刺激后组织中细胞钙离子变化的检测方法。. 将CdTe QDs与茉莉酸偶联得到茉莉酸受体探针，用多种方法对其表征。该探针可以特异性标记绿豆幼苗根部切片和拟南芥根尖植物中的茉莉酸受体；竞争实验说明该探针保持了茉莉酸的生物活性；3D重建实验显示该探针有很好的抗光漂白特性。. 将CdSe QDs和4-氨基-2-羟基苯羧酸偶联获得水杨酸受体探针。该探针能选择性检测植物水杨酸结合位点，能有效进入活体植物内；绿豆幼苗中激素结合位点主要分布在皮层组织的细胞壁、内皮原生韧皮部；探针保留了水杨酸对拟南芥刺激改变第二信使细胞钙离子浓度的特性。为了获得抗自发绿色荧光背景干扰的探针，合成了发红色荧光的水杨酸受体探针并进行应用。. 制备Mn2+掺杂的发红色荧光的CdTeMn QDs，其在光照下荧光稳定性比CdTe QDs大大增强，抗酸度和离子强度改变的能力强，具有更低的生物毒性。用CdTeMn QDs通过偶联制备了丁酰肼受体探针。与上述两个探针相比，该探针荧光强度大，生物毒性低，抗光漂白能力大大增强，对于自发荧光强度大的植物样品有良好抗背景效果。. 用偶联剂将乙二醇双(乙二氨乙基醚)四乙酸（EGTA）与巯基乙胺修饰的CdTe偶联，得到能选择性识别钙离子的荧光探针CdTe/MA-EGTA，该探针的灵敏度和抗光漂白性能高于商品化细胞钙离子探针Fluo-3/AM，可以检测用激素茉莉酸刺激拟南芥叶肉细胞后钙离子水平的改变，适用于长时间观察细胞钙的变化。. 本项目解决了信号转导缺乏测量信号这一关键问题，所建立的分析方法体现了分析化学正从传统研究物质的组成和结构，向研究物质在不同状态和演变过程中成分、含量和时空分布发展，是一项有意义的工作。