C5a受体介导血管内皮细胞损伤机制的研究

血管内皮细胞损伤是组织缺血/再灌注、多器官功能障碍、肿瘤转移及炎症免疫反应病理生理学基础。补体系统激活导致血管内皮细胞损伤和毛细血管通透性增强，机制尚不清楚，我们研究证实：C5aR介导血管内皮细胞损伤和血浆外渗，抗C5aR抗体和针对C5aR的siRNA可防治血管内皮细胞损伤。在C5aR介导或C5aR阻断前提条件下，研究内容：（1）模型建立：利用血管内皮细胞损伤的体外细胞培养模型和小鼠动物模型，分析培养血管内皮屏障功能变化，观察体内局部外周血管血浆外渗和重要脏器微血管血浆外渗变化；（2）细胞信号－骨架重组的分子水平：分析Rho/Rho激酶信号通路与细胞蛋白骨架重排关系；（3）细胞间和细胞－基质的分子水平：分析血管内皮细胞间－细胞外基质基质紧密蛋白和粘连蛋白分子的变化。探讨C5aR信号途径对血管内皮细胞损伤而致血管通透性增加的机制，为防治血管内皮细胞损伤相关的疾病提供基础性研究和新的治疗靶向。

研究并阐述C5aR 信号途径对血管内皮细胞损伤而致血管通透性增加的机制，为防治血管内皮细胞损伤相关的疾病提供基础性研究和新的治疗靶向；研究证实C5aR和uPAR这两种信号途径在脓毒症发生过程中能相互影响而促进先天性免疫应答，并且PKC-δ在调控调控C5aR和uPAR的表达及活化过程中发挥关键作用， PKC-δ有可能成为治疗脓毒症的新的靶点。.本课题研究证实：（1）设计了两套有效的小鼠C5aR干扰片段序列C5aR-517，C5aR-831，转染MEMECs细胞，分别从mRNA水平和蛋白水平分析该套系统的有效性；（2）根据NCBI数据库公布的小鼠C5aR氨基酸序列及其结构分析，合成该蛋白处于胞外N端氨基酸（37aa），制备高滴度的兔抗小鼠C5aR多克隆抗体；（3）构建了原代小鼠皮肤微血管内皮细胞的制备方法;（4）证实C5aR能够介导微血管内皮细胞的渗透性增加，细胞脱落加剧，改变了细胞内F-肌动蛋白池及G肌动蛋白池的浓度；（5）分析证实C5aR调控血管内皮细胞粘附分子（VCAM-1）的表达；（6）研究证实C5aR调控PKC-δ的表达及下游信号途径的活化；（7）证实C5aR调控NF-ƙB在细胞内的定位；（8）构建了C5aR-siRNA介导的C5aR表达抑制的动物模型，证实了C5aR在动物体内介导了多器官微血管系统的渗透性；（9）构建了小鼠盲肠结扎穿刺而诱导的脓毒症动物模型；（10）研究证实中和C5aR，抑制uPAR的表达及其下游信号途径的活化，而中和uPAR，抑制C5aR的表达及其下游信号途径的活化；（11）在脓毒症发生过程中，PKC-δ在补体活化系统及纤溶系统中均发挥了关键作用。.本研究提供新思路：（1）C5aR介导内皮细胞连接粘附分子的变化，从而导致血管内皮细胞屏障的变化；（2）C5aR介导微血管内皮骨架分子的重排诱发通透性的改变；（3）小鼠脓毒症动物模型，腹腔巨噬细胞C5aR信号途径与uPAR信号途径之间正反馈影响；（4）证实PKC-δ在C5aR与uPAR这两种信号途径活化过程中发挥关键作用； .进一步研究新计划：（1）进一步分析细胞信号通路与细胞骨架重组的分子机制；（2）从分子水平分析C5aR介导胞外基质变化的分子机制；（3）进一步分析PKC-δ对C5aR和uPAR这两种信号途径下游分子的影响；（4）以PKC-δ的抑制物来验证PKC-δ的中和是否改善脓毒症的发生。