药用植物箭叶淫羊藿类黄酮异戊烯转移酶基因的克隆与功能研究

The herba epimedii is one of the most popular traditional Chinese medicines that have been widely used for more than two thousand years.The herba epimedii has extensive pharmacological efficacy,including nourishing kidney, strengthening muscles and bones, as well as anti-aging and anti-tumor functions. The main bioactive constituents of epimedii are prenylated flavonoids (eg.icariin), and the isoprenoid is the significant difference in structure between the bioactive compounds and flavonol glucosides.The prenylation of flavonoids catalyzed by the aromatic prenyltransferase enzyme is demonstrated to be closely related to the biologcial activities of flavonoids.The substantive researches about extraction technology and pharmacology of flavonoids in herba epimedii have been developed,but the molecular mechanism to biosynthesize the prenylated flavonoids are still unclear.In this study,through transcriptome analysis and homology-based cloning method,the gene encoding flavonoid prenyltransferase in Epimedium sagittatum (EsPT) is isolated and functionally characterized in detail.Expression pattern of EsPT in various tissues is detected by realtime PCR analysis. Accumulation patterns of four bioactive components （icariin, epimedin A,B,C） in the different developmental stages of leaves are analyzed by HPLC assay. Promoter of EsPT is isolated by TAIL method and analyzed to dissect the corresponding reaction under various stresses. Molecular functions of EsPT is further analyzed and confirmed by subcellular localization,overexpression of EsPT in heterologous organisms and enzymatic activity in vitro experiments. Even biosynthesis of prenylated flavonoids (possibly icariin) in vitro is attempted. Our goal is to uncover the role of EsPT gene in the biosynthesis of the main bioactive components (prenylated flavonoids)in herba epimedii,paving the way for large-scale synthesis of icariin in vitro through metabolic engineering and creation of new cultivar with high content of icariin through transgenic technology.

淫羊藿是我国应用广泛、历史悠久的传统中草药之一，具有补肾阳、强筋骨、抗衰老、抗肿瘤等功效。淫羊藿中主要活性成分为异戊烯类黄酮（如淫羊藿苷），与黄酮醇骨架结构的主要差异在于异戊二烯基。研究表明异戊烯修饰与类黄酮的生物活性密切相关。相对于淫羊藿类黄酮分离鉴定和药理研究的日渐深入，对其生物合成途径研究甚少，特别是异戊烯修饰。本研究以箭叶淫羊藿为研究对象,通过转录组分析、同源克隆方法挖掘淫羊藿类黄酮异戊烯转移酶基因（EsPT），并对其进行详细的功能解析，主要包括定量PCR检测EsPT在不同组织中的表达模式；HPLC测定不同叶片发育时期四种活性成分的动态变化；分离EsPT启动子并检测其对不同环境胁迫的响应功能；通过EsPT超量表达和酶活性分析等实验验证基因功能；探索异戊烯类黄酮的体外合成。最终，揭示EsPT在淫羊藿主要活性成分生物合成中的作用，为代谢工程体外合成淫羊藿苷和新品种培育奠定基础。

淫羊藿为我国传统中草药之一，历史悠久，使用广泛。它因具有补肾阳、强筋骨、祛风湿、抗肿瘤等功效而备受关注。现代药理学研究证明淫羊藿中主要活性成分为类黄酮，特别是C8位置异戊烯化的黄酮醇苷类化合物。重要的是，大量研究表明异戊烯修饰可以显著增强类黄酮的生物活性，特别是在一些富含异戊烯修饰类黄酮的中草药中担任重要作用。尽管在淫羊藿中，我们已经解析了花青素和黄酮醇等类黄酮物质的合成途径，但是关于淫羊藿中类黄酮的异戊烯修饰还有待研究。我们以箭叶淫羊藿为研究对象，采用转录组分析结合同源克隆的方法找到了三条异戊烯转移酶基因（命名为EsPT1，EsPT2和EsPT3）。通过序列分析、组织表达、成分分析、亚细胞定位、启动子分析、转基因功能分析和酶活性分析等等方面来解析EsPTs基因的生物学功能，以揭示它们在淫羊藿活性成分合成中的作用。我们分析发现EsPT1极可能参与生育酚的合成，故在后续的转基因实验和酶活性分析中暂未考虑。结果显示EsPT2和EsPT3位于芳香族异戊烯转移酶进化树的基部，与参与香豆素异戊烯修饰的两个PT基因亲缘关系较近。EsPT2和EsPT3基因主要在叶片组织中表达，并且与四种活性成分（Icariin，Epimedin A，B，C）在叶片发育阶段的积累模式一定程度上正相关。响应于EsPTs基因具有7个跨膜螺旋的属性，亚细胞定位实验表明EsPTs主要在细胞质膜和核膜上表达。启动子驱动的GUS报告基因表达实验显示EsPT2和EsPT3有着多样的组织表达模式。然而值得注意的是，EsPT2和EsPT3超量表达于拟南芥和瞬间表达于本式烟草等实验结果显示它们似乎没有发挥应有的作用，高效液相色谱（HPLC）检测转基因植株中没有发现新的化合物产生。通过底物饲喂和体外酶活性分析等实验结果也表明EsPT2和EsPT3似乎没有发挥预期的功能，还有待进一步佐证。不过我们发现EsPT2对山奈酚（Kaempferol）底物极有可能发生作用。转基因实验和酶活性分析实验未出现预期结果的原因一方面有可能是新产生的化合物含量极低，不易检测；另一方面是底物饲喂能否有效渗入吸收和抽提微粒体（microsome）作为粗蛋白的使用问题；还有可能是候选基因的筛选有待进一步拓展。箭叶淫羊藿类黄酮异戊烯转移酶候选基因的挖掘和功能分析为解析主要活性成分的生物合成奠定基础，并为以后的代谢工程研究提供有效的候选基因。