AAV介导MIP3a-HBx-siRNA转染DC细胞诱导特异性CTL细胞抗HBV的实验研究

The reason of the Long-term infection with HBV is the decreased in the number of dendritic cells (DC) or functional defects, the cell can not produce the special cytotoxic lymphocyte response to against HBV. Thus, HBV can persistent replicate inside the liver cells in the long-term infection. MIP-3α is the most important chemotactic factor, which can enhance antigen uptake and antigen processing of DC. The HBV X (HBx) gene is consistently expressed in all four HBV viral mRNAs and thus an ideal target for developing viral inhibitors via a gene therapeutic approach. small interfering RNAs(siRNA) could decrease both viral RNA and protein levels, and completely block replication in cultured cells co-transfected with a siRNA expression plasmid and an HBV replication-competent vector. In the project, Generation and functional analyze HBV specific CTL elicited by DC transfected with recombinant adenovirus in vitro. Using recombination DNA technique construct HBx-targeted siRNA, the fusion expression plasmid of AAV/MIP-3α, and siRNA expression cassettes (SECs) containing AAV-MIP3α-HBx- siRNA. The human hepatoma cell HepG2 and M-TgHBV transgenic mice for evaluation of drugs treating hepatitis B virus is used to investigate the ACTL treatment anti-HBV effect and immunological mechanism, It also will lead to new strategies for therapies.

HBV患者树突状细胞(DC)数量减少和功能缺陷，不能产生有效的针对HBV特异的CTL反应，导致病毒持续复制不能被清除，是HBV长期感染的重要原因。MIP-3α 是DC最重要的特异性趋化因子，能够有效提高DC 递呈抗原的能力。HBx是抗HBV治疗的重要靶点，针对 HBV X 区设计siRNA 可能是清除病毒的最佳选择。本项目利用重组PCR技术构建靶向HBx的siRNA；利用反向遗传（病毒拯救）技术构建高效表达MIP-3α的重组病毒AAV/MIP-3α，借助AAV-Helper-free表达系统构建AAV-MIP3α-HBx- siRNA重组病毒质粒。转染DC细胞诱导产生高效特异抗HBV的CTL细胞。分别通过人肝癌细胞HepG2细胞、转染HBV质粒的HepG2.2.15细胞和M-TgHBV转基因小鼠乙肝模型，探讨ACTL抗HBV的治疗效果及免疫学机制，为抗HBV的临床治疗提供新的策略和思路。

本项目针对乙肝患者树突状细胞(DC)数量减少和功能缺陷，不能产生有效的针对HBV特异的CTL反应状态，利用重组PCR技术构建靶向HBx的siRNA；利用反向遗传技术构建高效表达MIP-3a的重组病毒AAV/MIP-3a，借助AAV-Helper-free表达系统构建AAV-MIP3a -HBx- siRNA重组病毒质粒。转染DC细胞诱导产生高效特异抗HBV的CTL细胞。 首先，以HepG2.2.15细胞为模型，观察转染AAV-MIP3a -HBx- siRNA对HBV表达和复制的影响及免疫刺激作用。用RT qPCR的方法检测了HBx基因的表达；用ELISA的方法检测了HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量变化。用RT qPCR的方法检测了IFN-a, ISG15和ISG56的mRNA表达水平；通过Western blotting检测 PKR 信号通路的活化，以及NF-xB信号通路中IkB的蛋白降解水平；应用萤光素酶报告基因实验观察ACTL对IFN-p的启动子序列的调控。最后，我们通过尾静脉高压注射ACTL细胞于Tg小鼠体内，观察其在小鼠体内的免疫激活作用和HBV抑制作用。比较了血清中HBsAg和HBeAg的含量变化，用ELISA法检测了小鼠血清中IFN-a的含量。研究发现AAV-MIP3a -HBx- siRNA能够沉默HepG2.2.1 S细胞HBx基因的表达，显著降低HBsAg和HBeAg的水平，并且这种抑制HBV的效果具有siRNA浓度依赖关系。ACTL细胞在通过活化RIG-I信号通路诱导干扰素和抗病毒蛋白的产生，还能诱导TNF-a等抗炎因子的表达，抑制TGF-p、IL-10等免疫抑制性因子的产生，从而有效逆转HBV所致的免疫耐受。可通过活化PKR信号通路激活肝细胞天然免疫应答，诱导干扰素和抗炎因子的产生，更加有利于ACTL细胞对HBV的抑制和清除。