FOXP3基因多态性对肾移植患者环孢素药效学的影响及机制研究

Cyclosporine A (CsA) is a calcineurin inhibitor widely used to prevent allograft rejection after solid organ transplantation. It is characterized by a narrow therapeutic index and high interindividual pharmacokinetic and pharmacodynamic variation, which is caused mainly by genetic factors. At present, pharmacogenetic study on CsA mainly focused on the pharmacokinetic genes, while relatively few on the pharmacodynamic genes. Recent studies showed that CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cell was also a target of cyclosporine. Our previous study found that FOXP3 gene polymorphisms were associated with the allograft rejection in Chinese renal transplant patients. In this study, we will explore the effects of FOXP3 gene polymorphisms on allograft rejection and lung infection related with CsA. Real time RT-PCR, western blot, flow cytometry, site-directed mutagenesis and luciferase reporter gene assay will be performed to investigate the effect of polymorphisms on the expression of FOXP3 gene. Electrophoretic mobility shift and chromatin immunoprecipitation assays, RNA interference are to be used to clarify the mechanism of polymorphisms affecting the FOXP3 gene function. This study is designed to search new potential genomic biomarkers to individualize the treatment of kidney transplant patients with CsA.

环孢素A广泛应用于预防器官移植术后排斥反应，具有治疗窗窄、个体差异大的特点。遗传因素是造成环孢素个体差异的主要原因之一。目前关于环孢素的遗传差异，研究主要集中于药动学相关基因，药效学基因相对较少。近年研究发现，CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞亦为环孢素的靶标。课题组前期研究显示，FOXP3基因单核苷酸多态性与中国肾移植患者排斥反应相关。本课题拟进一步考察FOXP3基因启动子区域的多态性对肾移植患者中环孢素相关排斥反应及肺部感染的影响；并用real time RT-PCR、western blot、流式细胞术、定点突变技术结合荧光素酶报告基因检测法等研究多态性对FOXP3基因表达的影响；应用凝胶电泳迁移率改变分析法、染色质免疫沉淀技术、RNA干扰技术阐明多态性影响FOXP3基因功能的分子机制，旨在为肾移植患者环孢素的个体化治疗寻找新的基因标志物。

研究目的及内容.考察FOXP3基因启动子区域单核苷酸多态性对环孢素（CsA）免疫抑制效应的影响，研究分为两部分（1）考察FOXP3基因多态性对CsA的药效及不良反应的影响，探讨CsA药效学个体差异的原因，为临床个体化给药提供参考。（2）考察FOXP3基因多态性对FOXP3基因表达及Treg细胞功能的影响，进一步阐明启动子SNP调控基因功能的机制。.重要结果及意义.建立了一系列本课题所用的实验方法，包括流式细胞术检测人外周血中T淋巴细胞活化标记物CD25和CD4+CD25+ Foxp3+ 调节T细胞（Treg）； ELISA双夹心法检测人外周血中 IL-2、 IL-10等；Taqman探针法进行FOXP3基因分型；MassARRAY时间飞行质谱法方法对CaN-NFAT通路相关基因分型。.在健康志愿者中，进行了CNI药物他克莫司的药效学研究，发现他克莫司能显著抑制T细胞表面CD25的表达，在应用他克莫司的肾移植患者中，研究发现CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞及miR-1827与排斥事件相关。.考察了FOXP3基因多态性对肾移植患者CsA药效学的影响，结果显示rs3761549位点对移植后肾功能有明显影响，C基因型的患者肾功能较T基因型更稳定。因此，FOXP3 rs3761549基因型可能对移植后肾功能的预测及环孢素的个体化给药提供一定帮助。考察了FOXP3基因多态性对中国汉族肾移植患者他克莫司药效学的影响，结果显示rs3761548位点的基因多态性与他克莫司肾毒性密切相关。rs3761548 AA/AC型患者比CC患者更容易他克莫司发生肾毒性，AA/AC型患者可能需要较弱的免疫抑制方案以免发生肾毒性。.全面考察了CaN-NFAT 信号通路的基因多态性对肾移植患者环孢素药效学的影响，表明NFATC1 rs3894049基因型对移植后急性排斥反应发生率有影响，而NFATC1 rs2280055位点则与肾移植术后eGFR水平变化相关。NFATC1 rs3894049 GC型患者与CC型相比更容易发生急性排斥反应，需要较强的免疫抑制方案；NFATC1 rs2280055 CC型患者肾功能下降比TT型快，需要密切关注。因此，检测NFATC1基因多态性可能有助于预测CsA的药效，提高使用CsA的肾移植患者的临床结果。