mcr-1基因与染色体固有脂多糖修饰/合成通路协同介导大肠埃希菌多粘菌素高水平耐药的机制研究

Polymyxin is considered to be the last resort for the treatment of infections caused by carbapenem resistant Enterobacteriaceae (CRE). The emergence of plasmid mediated colistin resistance gene, mcr-1, makes it possible for the widely horizontal transmission of polymyxin resistance in Enterobacteriaceae and is likely to cause a rapid dissemination of colistin resistant strains. At present, the role of mcr-1 gene in the development of bacterial resistance is still not fully clear. Our previous studies have shown that the mcr-1-positive strains were able to develop high-level colistin resistance (HLCR) and showed higher mutation rates in E. coli. In most of the HLCR mutants, mutations in genes mediating lipopolysaccharide (LPS) modification or synthesis were detected, indicating that the mcr-1 gene and chromosomal encoded mutations exhibited a synergistic effect to increase colistin resistance in E. coli. We are going to perform plasmid elimination and whole genome sequencing to further validate the synergistic effect of mcr-1 gene and chromosomal LPS modification/synthesis pathway in E. coli. The mechanisms of the synergistic effect will be elucidated by the analysis of structure of LPS/Lipid A and membrane potential, the comparison of expression levels of genes related to LPS modification/synthesis, and transcriptome analysis, so as to provide scientific basis for clinical prevention and control of polymyxin resistance.

多粘菌素是目前治疗碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染的最后一道防线。质粒介导多粘菌素耐药基因mcr-1的出现使肠杆菌科细菌多粘菌素耐药广泛水平传播成为可能，极有可能造成多粘菌素耐药的大范围流行。目前mcr-1基因对细菌耐药发展的作用仍未完全明确，本课题组前期研究发现mcr-1基因可以增加大肠埃希菌多粘菌素高水平耐药突变株的筛选窗，且在高水平耐药突变株中均可以找到与脂多糖修饰/合成相关基因的突变，提示mcr-1基因与大肠埃希菌染色体固有脂多糖修饰/合成通路间存在协同作用。本研究将采用质粒消除、全基因组测序等方法进一步验证mcr-1基因与大肠埃希菌染色体固有脂多糖修饰/合成通路的协同作用；通过对脂多糖/脂质A的结构和膜电位分析、介导脂多糖修饰/合成相关基因表达量比较、转录组分析等方法阐明mcr-1基因与大肠埃希菌染色体固有脂多糖修饰/合成通路的协同作用机制，为临床多粘菌素耐药防控提供科学依据。

目前碳青霉烯耐药肠杆菌已成为临床抗感染治疗面临的一大挑战，多粘菌素也被认为是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线。然而，随着多粘菌素耐药的不断被报道，目前，现有耐药机制并不能完全解释临床菌株对多粘菌素耐药的原因，本研究将进一步探讨肠杆菌科细菌对多粘菌素产生耐药以及异质性耐药的机制。.我们对22株临床分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌和5株碳青霉烯耐药大肠埃希菌进行了异质性耐药筛查，并通过测序筛选了异质性耐药亚群的突变位点。同时我们对前期研究中获得的表现高水平多粘菌素耐药、分别在mgrB及双组分调控系统基因上存在突变的一批大肠埃希菌进行了分析，检测想过基因的表达量及转录组测序，来验证mgrB及双组分调控系统基因突变后调控通路的变化。.实验结果显示，目前在碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌对多粘菌素有很高的异质性耐药率，其中mgrB基因失活是肺炎克雷伯菌产生异质性耐药的主要原因，此外双组分系统pmrA-pmrB、phoP-phoQ中的特定突变也是部分菌株对多粘菌素的异质性耐药的原因，但其检出率明显要低很多。并且异质性耐药亚群发生在无多粘菌素的扩增期，而不是在接受多粘菌素压力后发生的。在大肠埃希菌中mgrB的失活不会介导多粘菌素耐药，因为它的失活并不会使phoP-phoQ的表达量明显升高，同时pmrD在大肠埃希菌中也存在功能缺失不会导致pmrA及其下游基因的表达量变化，最终使mgrB失活的大肠埃希菌对多粘菌素仍然敏感。对比mgrB基因在肺炎克雷伯菌中对多粘菌素异质性耐药的重要意义，也可以确定大肠埃希菌对多粘菌素并不存在异质性耐药的原因就是mgrB失活不会使大肠埃希菌对多粘菌素耐药。.多粘菌素耐药是CRE感染治疗的最后一道防线，其抗菌机制、耐药机制以及异质性耐药方面尚未完全被人们认识清楚，所以进一步明确大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在对多黏菌素产生异质性耐药的过程中细菌双组分调控系统及其调控基因作用的具体分子机制，可以为临床使用多黏菌素抗感染治疗提供指导，避免错误使用多黏菌素导致抗感染治疗方案失败的情况。