核糖体展示技术筛选Anti-Gremlin Adnectins及抑制肝纤维化作用研究

Gremlin能拮抗骨形成蛋白BMPs和激活VEGFR2介导的信号转导通路，是纤维化过程中重要的促进因子，阻断Gremlin可抑制纤维化发生、发展。由Ⅲ型纤维连接蛋白衍生设计的半人工蛋白分子Adnectins具有结构稳定、组织渗透性好、可以在大肠杆菌内高效活性表达、抗原性弱等优点，具有高亲和力及高特异性，可模拟抗体结合及中和靶蛋白分子，是目前最具应用前景的蛋白药物。本课题采用核糖体展示技术筛选能特异结合和阻断Gremlin生物学活性的Adnectins，体外实验观察其对肝星状细胞增殖、转化及分泌细胞外基质的抑制作用；构建表达Anti-Gremlin Adnectins重组AAV，介导其在胃肠道持久表达，克服Adnectins半衰期短、需要反复注射使用的缺点，观察对实验性模型鼠肝纤维化的抑制作用，为肝纤维化的防治研究提供新的思路，同时研究结果也可扩展至心、肾、肺等重要脏器纤维化的研究领域。

本课题采用利用PCR扩增及基因合成构建Adnectin半随机核糖体展示文库，经限制性内切酶及DNA测序证实了文库结构的正确性和文库序列的多样性，对文库转化菌的滴定和插入失活蓝白菌斑筛查和计数测定计算，文库的库容为1.54×1013 /ml。构建文库经体外转录及翻译，筛选候选Adnectins核酸序列，通过检测对鼠软骨细胞ATDC5 BMP4诱导产生碱性磷酸酶活性抑制作用，筛选获得具有较强拮抗Gremlin作用的Anti-Gremlin Adnectins（定义为AGA）。通过MTT观察AGA对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞的作用，筛选的AGA明显抑制Gremlin对细胞的增殖作用，实时荧光定量检测AGA组Ⅰ、Ⅲ型胶原、层粘连蛋白、TIMP-1 mRNA含量较对照组明显降低， AGA具有抑制HSC-T6 细胞合成和分泌ECM 的作用。构建包装表达此AGA的重组腺相关病毒（定义为AAV/AGA），AAV/AGA治疗组Ishak 肝纤维化评分明显低于CCl4模型组。MASSON染色及天狼猩红染色显示治疗组肝纤维化程度轻，PCNA免疫组化结果显示，AGA治疗组抑制肝组织内间质细胞增殖，促进肝实质细胞增殖；AGA治疗组肝组织内α-SMA分布面积及肝组织羟脯氨酸含量明显低于CCl4组， AGA治疗组肝纤维化程度低于CCl4组。本研究使用基因合成和PCR扩增两者相结合方法，成功的构建Adnectin半随机的核糖体（mRNA）展示文库，该文库构建方法较之前传统方法简单，库容量大，为构建亲和各种相关蛋白的Adnectin结合序列奠定基础,筛选获得能特异结合和阻断Gremlin生物学活性的Adnectins，构建表达此AGA的重组AAV对实验性模型鼠肝纤维化的具有较好的抑制作用，为器官纤维化治疗提供了新的思路。目前已发表专业学术论文三篇，其中SCI一篇。