茅苍术细胞中3种主要倍半萜的合成途径探讨及其代谢调控研究

Atractylodes lancea (Thunb.) DC. is an important genuine medicinal plant distributing in Maoshan, Jiangsu Province. The main active components of A. lancea comprise three characteristic sesquiterpenes, including β-eudesmol, atractylone, and hinesol. Although the main active components of A. lancea have been clarified, there are still several problems existing. On the one hand, the resources of wild A. lancea have decreased sharply. On the other hand, the artificial cultivation of A. lancea is difficult and the active components of cultured A. lancea are different from those of wild ones. Therefore, the regulations of active component production have showed a plateau phenomenon.. The project intends to consider the biosynthesis mechanism and production of active pharmaceutical components in A. lancea from the cellular perspective. Firstly, the biosynthesis mechanism of β-eudesmol, atractylone, and hinesol will be explored via the gene cloning and the additions of precursors labeled by stable isotope. Secondly, the metabolic network of these three sesquiterpenes in A. lancea cells will be set up and improved via the metabolic disturbance and the proteomics analysis. Thirdly, the strategies based on the metabolic engineering will be adopted to achieve effective regulations and efficient syntheses of target products.. This project firstly explores the biosynthetic pathway and transform mechanism of three main sesquiterpenes in A. lancea. Based on these researches, the constitution of volatile oils in A. lancea can be regulated more properly, which is benefit to improve the quality of genuine medicinal materials. Besides, we hope these three substances can be produced efficiently through biochemical engineering, which can satisfy the demands of natural product exploitations. Therefore, this study can provide the theoretical foundations and technical supports for the industrial applications of genuine medicinal materials of A. lancea.

源自江苏茅山地区的茅苍术是一种重要的道地性药用植物，它所合成的β-桉叶油醇、苍术酮和茅术醇3种倍半萜是其主要的活性成分。目前存在的问题是虽然其活性成分已阐明，然而茅苍术天然资源日趋衰竭，人工栽培困难且成分与野生差异很大，活性成分的调控研究已进入瓶颈期。本项目从3种倍半萜间的转化关系入手开展研究，首先通过基因克隆、稳定同位素示踪技术等手段探索茅苍术细胞中β-桉叶油醇、苍术酮和茅术醇的合成规律，并借助蛋白组学方法完善其代谢途径；然后利用细胞代谢工程策略实现成分间合理的配比与高效生产。该研究首次探讨3种主要倍半萜在茅苍术中的合成途径与转化关系，可填补其有效成分在合成机理研究上的空白。一方面希望能够藉此合理调控主要组分，提升茅苍术作为道地性中药资源的品质；另一方面从天然产物开发角度期望3种成分也能作为单一产品通过生物化工手段实现高效生产。研究将为道地性茅苍术的产业化应用提供理论依据与技术支撑。

源自茅山地区的茅苍术是一种重要的道地性药用植物，它所合成的倍半萜是其主要的活性成分。目前存在的问题是茅苍术天然资源日趋衰竭，人工栽培困难且成分与野生差异很大，活性成分的调控研究缺乏依据。本项目以茅苍术组培苗和悬浮细胞为研究对象，针对其合成活性成分中包括β-桉叶油醇、苍术酮和茅术醇在内的几种主要倍半萜的合成与调控开展研究：（1）针对茅苍术遗传背景不清楚的问题，采用了RNA-Seq技术对茅苍术进行了系统的转录组分析，在此基础上对茅苍术中几种主要倍半萜的生物合成途径进行了较系统的研究。这部分研究工作基于代谢物定量和转录组分析，系统探讨了茅苍术在实验室无菌条件组织差异性分化后倍半萜的分布规律，将为茅苍术倍半萜的合成调控研究奠定理论基础。（2）成功建立了一套完整的同时适用于茅苍术根、茎、叶各组织的从高纯度质膜蛋白的制备到膜蛋白的质谱鉴定分析的蛋白质组学技术，将为茅苍术主要药用成分的合成途径探索、调控机理研究提供技术支撑；同时首次报道了一种来源于茅苍术内生真菌的结构新颖的胞外甘露多糖，并基于膜蛋白质组学系统的提出了一种茅苍术倍半萜在生物胁迫调控扰动条件下的代谢机制。（3）成功克隆了茅苍术中一个重要倍半萜β-石竹烯的合酶基因CS2，并对β-石竹烯的体内转化及CS2基因在大肠杆菌中的表达进行了初步研究，在大量文献资料和数据库中相关途径的基础上，对菊科植物中的倍半萜代谢途径进行了系统分析，初步建立了茅苍术中倍半萜的生物合成代谢网络。后续研究有赖于进一步鉴定到的重要蛋白酶和关键合成基因数据对该网络进行完善和修正。（4）进一步研究了包括高温和干旱在内的非生物胁迫因素对茅苍术倍半萜的调控，并比较了非生物胁迫调控和生物胁迫调控之间影响的差异。同时将茅苍术悬浮细胞培养体系进行了摇瓶水平上的优化调控，在此基础上实现了5 L发酵罐水平的茅苍术悬浮细胞培养与倍半萜生产，将为后续代谢网络尺度上的代谢调控提供基础。