促红细胞生成素模拟肽与创伤性脊髓损伤的相关性研究

创伤性脊髓损伤是脊柱外科常见病。高致残率多数因为急性损伤后级联式的继发性损伤，其病理生理过程涉及能量障碍、兴奋性毒性、炎症反应、细胞凋亡、氧化应激、神经营养因子缺失等多个环节的多个层面。目前多数药物只作用于某一具体环节，临床需要联合应用多种神经保护剂。近些年发现一直用于贫血症治疗的促红细胞生成素具有强大的神经保护潜力，并在多个种属动物的脊髓损伤模型上得到肯定，但因存在生血活性毒副作用未能通过Ⅲ期临床试验，所以发展促红细胞生成素衍生物成为神经保护药物开发的重点。通过对氨基酸序列及其受体的结构域进行缜密分析，申请者设计并合成了若干个含8-12个氨基酸的模拟肽，经表面等离子共振仪检测，与原位受体的抗体Fc段具有很高的结合力。体外试验结果揭示它们无生血活性，但有明显的神经保护作用。根据创伤性脊髓损伤发生发展机制，围绕脊髓组织水肿、兴奋性毒性、炎症反应和细胞凋亡四个方面，观察其对模型大鼠的整体疗效。

发展人工改造的促红细胞生成素（EPO）模拟肽，在突出神经保护效应同时减少其血源活性，是目前脊髓损伤药物开发领域一个比较活跃的方向。通过对EPO及其受体的结构域分析，申请者设计并遴选出一个含16个氨基酸的模拟肽，并对其与脊髓挫伤的相关性进行研究。在伤后30min皮下注射模拟肽能减轻组织水肿，减少细胞凋亡和调制炎症反应，但基本无生血作用。建立制备过程相对标准化的脊髓挫伤大鼠模型，并经ImageJ软件测量初始损伤体积呈近视正态分布，损伤程度可控性高；将动物步态分析系统应用于评价模型成败和判断药物疗效，所选用的运动步态参数既敏感又客观；借助HE染色观察大体组织学改变，铜银染色显示运动神经元及其轴突的溃变和固蓝染色显现白质部的脱髓鞘区域，并且采用Image pro-plus图像分析系统计算残余髓鞘面积。模型具有与人类疾病发生、发展过程相吻合的临床病理学特征。实际损伤程度、运动步态的改变和损伤组织的病理学三者较为一致。静脉血经EDTA-Na2抗凝后即时检测RBC、HGB和HCT；血样经肝素钠抗凝后检测全血粘度。模拟肽组的RBC、HGB、HCT、全血低切黏度和中切黏度均显著低于rHuEPO组，与甲强龙组无显著性差异。在伤后不同时间点切取脊髓损伤组织，采用干湿重法按Ellicot公式计算含水量。模拟肽组的组织含水量均显著低于模型组。采用ELISA法检测损伤中心及其前后3、5mm处AQP-4的表达，结果与组织水肿程度基本成正相关。采用RT-PCR法检测损伤中心及其前后5mm处组织中IL-1β、IL-10、TNF-α和CINC-1 mRNA的表达。另外，采用ELISA法检测组织匀浆中IL-1β、IL-10, TNF-α、CINC-1的蛋白含量。在伤后6、24h，模拟肽组 IL-1β、TNF-α、CINC-1的mRNA表达和蛋白含量均显著低于甲强龙组,然而IL-10的mRNA表达和蛋白含量均显著高于甲强龙组。采用TUNEL染色检测损伤中心及其前后3、5mm处双侧白质阳性细胞，模拟肽组的凋亡细胞数和凋亡指数均显著低于甲强龙组，然而其抑制细胞凋亡的程度不如rHuEPO显著。采用NeuN和GFAP免疫组化技术观察损伤中心及其前后3、5mm处灰质前角神经元存活数量和星形胶质细胞表达。除损伤中心外，神经元存活数量均显著高于甲强龙组，而且抑制星形胶质细胞过度增生效果明显。