酶法选择性合成单一类型环糊精的控制策略研究

由于环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用淀粉所合成产物为α-、β-和γ-环糊精混合物，不利于单一类型环糊精的分离纯化，因此，着力于提高酶法合成过程中单一类型环糊精的选择性显得尤为重要。本项目主要从CGT酶产物特异性和复合剂两个方面对酶法选择性合成单一类型环糊精进行一定的应用基础研究。首先，针对CGT酶产物特异性上的不足，采用理性设计方法解析酶产物特异性与其一级结构的相关性，获得构建具有理想产物特异性的CGT酶突变体的方法；其次，为了避免选择有机化合物作为复合剂的盲目性，分析结合常数与环糊精选择性之间的相关性，为筛选能促进单一类型环糊精合成的复合剂提供理论依据；最后，进一步了解CGT酶产物特异性和复合剂之间在控制环糊精选择性合成上的协同作用，并总结出酶法选择性合成单一类型环糊精的控制策略。这些控制策略将为从本质上改善单一类型环糊精的选择性合成提供理论基础，对环糊精工业化生产具有普遍指导意义。

由于环糊精葡萄糖基转移酶（CGT酶）作用淀粉所合成产物为α-、β-和γ-环糊精混合物，不利于单一类型环糊精的分离纯化，因此，有必要提高酶法合成过程中单一类型环糊精的选择性。本项目首先解析了酶产物特异性与其一级结构的相关性，获得了构建具有理想产物特异性的CGT酶突变体的方法；其次，筛选了能促进单一类型环糊精合成的复合剂，分析了包合稳定常数与环糊精选择性之间的相关性；同时，总结了酶法选择性合成单一类型环糊精的控制策略。这些策略为从本质上改善单一类型环糊精的选择性合成提供了理论基础，对环糊精工业化生产具有指导意义。.主要完成的工作包括：.1. 采用两阶段温度控制策略提高了重组α-CGT酶在大肠杆菌中的胞外分泌，并提出了内膜硬化理论；实现了来源于环状芽孢杆菌的-CGT酶在枯草芽孢杆菌中的胞外过量表达，并采用疏水、阴离子交换层析对重组酶进行了两步纯化，并对其理化性质进行了分析。.2. 通过理性设计改善了CGT酶的产物特异性。将钙离子结合位点CaI处Ala31突变成精氨酸和脯氨酸明显提高了来源于环状芽孢杆菌的CGT酶的β-环糊精特异性，β-环糊精产量比野生酶分别提升了25.8%和16.1%；相比而言，Ala31突变成丝氨酸提高了CGT酶的α-环糊精特异性，而突变为谷氨酸提高了酶的γ-环糊精特异性。将位点CaIII处Ala315突变成亲水性较强的氨基酸残基也能提高CGT酶的β-环糊精特异性，突变体A315R和A315D的β-环糊精产量比野生酶分别提高15.1%和10.8%。β-环糊精特异性的提高可使突变体更适合于β-环糊精的工业化生产，可能的原因是突变稳定了CGT酶的钙离子结合位点，从而稳定了酶的特定构象。.3. 在环糊精酶法生产中，一元直链醇对α-环糊精合成有明显促进作用，且效果远好于同碳原子数的支链醇和二元醇。C8以上的一元直链醇对α-环糊精合成的促进效果最好，α-环糊精得率能提高5~6倍；当乙醇和正癸醇同时添加作为复合剂时，可在保证α-环糊精得率的基础上，明显减少正癸醇用量，进一步降低α-环糊精生产成本。部分醇类和烷类物质对β-环糊精合成有明显促进效果，其中环己烷添加量为1.5%时，β-环糊精得率达到56.7%。复合剂与环糊精的包合稳定常数与其对环糊精制备的影响之间存在着对应关系，包合稳定常数越大，复合剂与环糊精所形成包合物的稳定性越强，越能促进对应环糊精的合成。