靶向HIV-1 gp41和gp120高保守区的纳米抗体-CD4单域大分子的构建及功能研究

The currently available HIV-1 neutralizing monoclonal antibodies (nmAbs) mainly target the epitopes on gp120 surface (e.g., CD4 binding site, CD4-induced epitope, high-mannose oligosaccharides) or that of gp41 (e.g., membrane-proximal external region), which are susceptible to mutations with resistance to these nmAbs. The highly conserved pocket in the HIV-1 gp41 NHR-trimer with transit exposure for a very short period of time during the virus-cell fusion is an ideal target for the development of broad-spectrum nmAbs. However, the whole antibody IgG molecule (~ 150kD) is too big to access to this target site because of the Steric and kinetic barriers. Here, we intend to construct gp41 NHR-trimer antigens and use them to screen our established extremely large human nanobody (HnAb) library for obtaining broad-spectrum HIV neutralizing HnAbs with small molecular weight (~ 15kD). Next, we will use antibody-drug conjugate strategies to link HnAb with a single CD4 domain (mD1) and a cell membrane-lytic peptide (LP). This three-specific anti-HIV molecule (mD1-HnAb-LP) is expected to attack HIV with three hits at once, which not only inhibits HIV infection and inactivates HIV virions, but also kill HIV-infected cells and the activated latent HIV-infected cells, thus accelerating HIV latent library cleared achieve functional HIV cure purposes. Therefore, the present study will open a new avenue for developing strategies for AIDS treatment and HIV cure.

现有的靶向HIV-1包膜蛋白的中和单克隆抗体均靶向gp120和gp41表面暴露的抗原位点，这些位点突变易产生中和抗体逃逸株。HIV-1 gp41 NHR三聚体的口袋区非常保守，且只在病毒发生融合时瞬间暴露，是一个研发广谱单抗的理想靶点。但由于瞬时暴露所造成的空间位阻和动力学障碍，完整的抗体分子很难进入该靶点发挥作用。因此，我们拟构建模拟NHR三聚体的抗原，对本室拥有的超大型全人源纳米抗体（HnAb）库进行筛选，期望获得具有广谱HIV中和活性的小分子量HnAb，并使用抗体-药物偶联策略将HnAb与靶向gp120高保守区的CD4单域（mD1）分子和可溶解HIV感染细胞膜的溶膜素（LP）共价连接形成三功能生物大分子（mD1-HnAb-LP）。它既可抑制HIV感染，又可杀灭HIV感染细胞和被激活的HIV潜伏感染的细胞，可清除病毒潜伏库。 因此，本课题研究为艾滋病的治疗尤其是功能性治愈提供了新的方向

治愈艾滋病目前仍是HIV/AIDS研究领域的挑战。现在已经有许多靶向HIV-1包膜蛋白gp120和gp41表面暴露抗原位点的中和单克隆抗体，但这些位点突变易产生中和抗体逃逸株。HIV-1 gp41 NHR三聚体的口袋区非常保守，只在病毒发生融合的过程中瞬时暴露，是一个研发广谱中和抗体的理想靶点。但由于瞬时暴露所造成的空间位阻和动力学障碍，完整的抗体分子很难进入该靶点发挥作用。纳米抗体或单链抗体分子量小，能克服空间位阻的问题而与该靶点结合。因此，在本研究中，我们设计构建了四种模拟gp41 NHR三聚体的抗原，分别通过筛选全人源纳米抗体酵母展示库和免疫羊驼获得的NHR特异性的纳米抗体噬菌体展示库，成功筛选到纳米抗体NB328-172。该纳米抗体能特异性结合gp41 NHR，并且可以中和HIV-1 Bal感染。同时，我们还以报道的单链抗体D5 scFv为基础，成功表达了该单链抗体。研究发现D5 scFv能中和HIV-1感染，在与靶向gp120的蛋白mD1.22联合使用时，对抑制HIV-1感染具有协同作用。单独使用时D5 scFv不能灭活游离病毒颗粒，但二者联合使用时，D5 scFv能增强mD1.22对HIV-1 游离病毒颗粒的灭活作用。进一步我们使用不同长度的柔性连接子连接mD1.22和D5 scFv，构建了五种双靶点融合蛋白（DLDs）。DLDs均能有效的结合gp120和N63-trimer，且可以阻断六螺旋的形成。DLDs能有效地抑制多种HIV-1感染，并且能有效地灭活游离的病毒颗粒，活性在低纳摩尔水平。其中连接子为35-mer的融合蛋白DL35D活性最佳。因此，我们将DL35D与微管蛋白抑制剂DM1偶联，构建了三功能生物大分子DL35D-DM1。研究发现DL35D-DM1不仅能有效地抑制HIV-1感染，灭活病毒颗粒，还可以特异性地杀伤HIV-1感染的细胞H9 /HIV-1IIIB细胞，同时其也能特异性杀伤罗米地辛激活的潜伏感染细胞ACH-2，而对未感染的HIV-1细胞、未激活的HIV-1潜伏感染细胞及多种未感染的人类细胞均没有明显的杀伤作用，说明构建的DL35D-DM1具备进一步开发为新型HIV治疗/治愈药物的潜力。因此，本课题研究为艾滋病的治疗尤其是功能性治愈提供了新的方向。