钙信号系统调控烟曲霉生物膜应对低热作用的机制研究

Calcium signaling system (Ca2+-CaM) played an important role in activities of fungal growth, development, proliferation, stress response and so on. In vitro heat stress inhibited the formation of Aspergillus fumigatus biofilms. We speculated that calcium signaling system was an important cell signaling system to respond to external stimulation, involved in the feelings, transmission and response of the former process. To investigate these issues, we intended to perform the following studies by using the strains of green fluorescence protein-calmodulin (GFP-CaM) against heat stress: (1) To detect changes of concentration of intracellular calcium by a laser scanning confocal microscope; (2) To detect the expression level of six important Ca2+-inducible genes (cchA, midA, cnaA, crzA, pmrA and pmcA) in calcium signaling system by RT- PCR method; (3) To detect the dynamic localization of GFP-CaM in isolate by fluorescence microscope; (4) To observe the polar growth of spores and the formation of biofilm by the use of laser scanning confocal microscopy. We aim to reveal the mechanisms of calcium signaling pathway on aspergillus fumigatus against heat stress and the relationship between polar growth and biofilm formation.

钙信号系统（Ca2+-CaM）参与真菌的生长、发育、增殖和逆境响应等多种重要生命活动。外界低热作用能够抑制烟曲霉生物膜的形成。我们推测钙信号系统作为菌体应对外界刺激的重要信号系统，参与了上述过程的感受、传递和响应。为了研究该问题，我们拟通过低热作用于绿色荧光蛋白标记的钙调素菌株（GFP-CaM）进行以下研究:（1）使用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度的变化；（2）使用RT-PCR方法检测钙信号系统中主要蛋白编码基因cchA、 midA、 cnaA、 crzA、 pmrA和 pmcA的表达变化；（3）使用荧光显微镜检测GFP-CaM的时空分布变化；（4）使用共聚焦显微镜观察孢子极性生长情况及生物膜形成情况。通过上述研究可初步揭示钙信号系统调控烟曲霉应对低热作用的机制及钙信号系统与烟曲霉极性生长及生物膜形成的关系。

侵袭性烟曲霉病的发病率在过去十年中显著的升高。在侵袭性肺曲霉病患者的支气管肺泡灌洗液检查和尸体检查中发现了膜样结构物质。这种膜样结构正是烟曲霉的生物膜形态。进一步实验发现其生物膜状态较游离状态对药物的抵抗能力升高近1000倍。为此我们试图寻找一种安全、相对经济的办法来提升抗真菌药物的敏感性。文献检索发现外源性的持续低热效应常被用于肌肉拉伤和恶性肿瘤方面的疾病。钙信号系统一直以来被认为是调节生命活动的重要环节。本研究的主要内容是通过启动子替换技术、红色荧光蛋白标记技术和融合PCR 技术构建乙醇脱氢酶启动子调控的GFP-CaM烟曲霉菌株。测定低热作用下钙调素时空分布变化、菌丝极性生长变化、生物膜形成差异及钙调素信号通路中的相关基因的表达。本研究成功构建了乙醇脱氢酶启动子调控的GFP-CaM烟曲霉菌株。结果显示钙调素蛋白在处于烟曲霉菌丝顶端时，菌丝表现为极性生长，生物膜的厚度形成较厚。因此我们认为钙调素蛋白能够调控烟曲霉菌丝的极性生长及生物膜的结构。并进一步发现该菌株能够通过调控钙调素蛋白的时空分布、钙调素系统的相关基因的表达来应对低热作用。本研究合成的荧光蛋白标记的钙调素蛋白菌株具有钙调素表达可调控性及在活体菌株中直接显色的特点。利用此菌株本研究可直观动态观察钙调素在菌株生长过程中的分布及在低热作用下其时空定位变化情况。这将有利于观察钙信号系统是如何调控烟曲霉应对低热作用及其他可能影响钙调素信号系统的研究提供研究基础。