EIN4调控番茄果实硬度的功能验证及机理解析

Fruit firmness is very important for tomato storage and transportation, however, the regulation molecular mechanism on tomato fruit firmness is still unclear. We determined the firmness of red fruit of 269 diverse global collection of tomato accessions at two locations in our previous study. According to analysed the GWAS result of fruit firmness, we found out an ethylene receptor gene (EIN4-like protein) on chromosome 4. We compared the gene sequence in lower and higher fruit firmness respectively, then we found out there was a single nucleotide polymorphism (A→G) result in an amino acid mutation (Lys→Glu) between them, so we assumed that this gene should has the function of regulating the fruit firmness. From an evolutionary perspective, we considered the genotypic variation should be one of the reason for the change of fruit firmness. We build the overexpression and Crispr vectors and obtain the transgenic seedlings getting through genetic transformation for further study. Also, the interaction proteins of EIN4 gene will be identified and compared by yeast two-hybrid and co-immunoprecipitation. By combining these data with the RNA-seq data, we will find candidate genes related to fruit firmness and try to explain how EIN4 contributes to fruit firmness regulation.

果实硬度对番茄贮藏运输具有重要的意义，然而目前番茄果实硬度的调控机理尚不明晰。申请人前期对一年两试验点的269份自然群体重测序材料的红熟期果实硬度的表型进行了鉴定，通过GWAS关联到第4条染色体上一个乙烯受体基因(EIN4-like蛋白)，通过对软果、硬果极端材料的基因序列进行比对，发现在两种极端材料中有一个核苷酸A→G的变化，直接导致了氨基酸Lys→Glu的变异，从进化角度分析，认为该基因型的不同是导致番茄果实硬度变化的原因之一。进一步在克隆和鉴定番茄乙烯受体EIN4调控功能的基础上，采用酵母双杂和免疫共沉淀等技术确定该基因的互作蛋白，结合转基因材料的转录组数据，挖掘出相关调控果实硬度的候选基因，全面解析由其介导的果实硬度调控途径。

番茄(Solanum lycopersicum)是全球价值最高的蔬菜作物之一，其中果实硬度对番茄的贮藏和运输至关重要，很大程度上影响了番茄的经济效益，因此挖掘出调控番茄果实硬度的基因非常重要。本项目前期在两个地点对全球267份不同番茄种质的红熟期果实硬度进行了测定，根据果实硬度的全基因组关联分析和遗传连锁分析的结果，在番茄第4号染色体上发现了一个乙烯受体基因SlEIN4。目前的研究结果表明，SlEIN4蛋白定位于细胞膜，并且该基因在果实绿熟期表达量最高。通过构建过表达和CRISPR/Cas9基因编辑SlEIN4的重组载体，并转化番茄Micro Tom获得转基因株系，发现基因编辑SlEIN4植株可使番茄果实提前成熟，红熟期果实硬度高于野生型对照，但过表达SlEIN4后果实成熟延迟，红熟期果实硬度低于对照。此外，我们还观察到基因编辑SlEIN4后，果实果形指数显著升高，而过表达株系变化不明显。综上所述，SlEIN4基因在番茄果实成熟进程中发挥了重要的功能，同时调控了番茄果实成熟、硬度及果形，这也是乙烯受体类基因首次发现在果实硬度及果形中发挥了调控功能，这些发现为研究番茄果实硬度的自然变异提供了新的遗传学见解，并将促进在番茄改良中有效利用硬度性状。