MSTN基因敲除对猪骨骼肌纤维类型及成脂分化信号途径影响的研究

MSTN not only inhibits the growth and development of skeletal muscle cells, but also participates in the growth, differentiation and metabolic regulation of fat. Since pigs are similar to human organs in size and physiology, the MSTN gene modified pig is an ideal animal model to study muscle and fat-related diseases. Our group used gene editing technique to successfully obtain dozens of MSTN knockout cloned pigs. In the previous research work, we found greater difference in skeletal muscle fiber types between MSTN genetically modified pigs and wild type. And then, the distribution of type Ⅱ muscle fiber proportion significantly increased in genetically modified pigs compared with wild type and the mRNA of myosin heavy chain subtypes MyHCIIb corresponding to typeⅡ muscle fiber also improved dramatically. Meanwhile, it was found that the MSTN gene mutation can result in the decrease of subcutaneous fat, while promoting the adipocytic differentiation of myosatellite cells. This project intends to use MSTN gene knockout pig to conduct dedicated research with the mechanism of MSTN regulating muscle fiber type conversion and adipocytic differentiation. It provides some references for the research of skeletal muscle development, muscle and fat related-disease and pork quality improvement.

MSTN不仅抑制骨骼肌的生长发育，同时参与脂肪的生长、分化和代谢调控。由于猪的器官大小、生理学等方面与人很相似，所以MSTN基因修饰猪是研究调节肌肉及脂肪相关疾病的理想动物模型。本课题组利用基因编辑技术成功获得数十头MSTN基因敲除的克隆猪。在前期研究工作中，我们发现MSTN基因敲除猪与野生型猪相比骨骼肌纤维类型的分布存在很大差异，Ⅱ型肌纤维比例明显增多，Ⅱ型肌纤维对应的肌球蛋白重链亚型MyHCIIb的mRNA表达量也明显提高。同时，发现MSTN基因突变导致皮下脂肪减少,但是反而促进了肌卫星细胞成脂分化。本项目拟利用MSTN基因敲除猪，深入探讨MSTN调节肌纤维类型转化及脂肪分化机制，为骨骼肌生长发育、肌肉脂肪相关疾病和猪肉质改良研究提供一定的参考。

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN），也称为生长分化因子-8（Growth differentiation factor-8，GDF-8），是转化生长因子β（Transforming growthfactor-beta，TGF-β）超家族成员之一，对骨骼肌的生长具有负调控作用，其活性的缺失会引起动物肌肉的过度发育。MSTN不仅有抑制骨骼肌生长发育的功能，还参与脂肪组织的生长、分化和代谢的调控。由于猪的器官大小以及生理学功能等方面与人很相似，因此MSTN基因修饰猪是研究调节肌肉及脂肪代谢相关疾病的理想动物模型。在前期研究工作中，发现MSTN基因敲除猪与野生型猪相比，II型肌纤维比例明显增多。同时发现MSTN基因突变导致皮下脂肪显著减少。本研究利用MSTN基因双侧敲除猪，深入探讨MSTN基因调节肌纤维类型转化及脂肪分化机制，并成功分离培养了野生型和MSTN基因双侧敲除猪的骨骼肌卫星细胞。研究结果证实，MSTN基因敲除猪的股二头肌和膈肌均表现出IIb型-肌纤维比例增多。且qRT-PCR和 Western Blot 结果表明，MSTN基因敲除猪骨骼肌内MHC-IIB的mRNA和蛋白表达量都显著高于WT猪。通过检测MSTN下游调节因子，ActR-II受体及Smad2/Smad3蛋白复合体，结果表明，MSTN在肌肉发育过程中通过调节Smad2/Smad3的磷酸化及MRFS和MEF2家族，调控肌纤维类型组成MSTN基因敲除对猪皮下脂肪组织生成起着重要调节作用。通过组织形态学及分子生物学检测发现，缺失功能性的MSTN会导致猪皮下白色脂肪的米色化。通过对下游调节通路的研究发现，MSTN基因敲除猪脂肪组织内AMPK通路处于激活状态，伴随着骨路肌分泌的细胞因子IL-6显著增加。体外细胞实验结果表明，MSTN基因敲除猪骨骼肌细胞分泌的IL-6抑制脂肪细胞内脂肪生成相关基因的表达。因此，MSTN基因敲除后可能通过增加骨骼肌分泌IL-6蛋白，激活脂肪细胞内的AMPK通路，抑制脂肪生成。本研究通过对猪肌肉生长抑制素基因影响骨骼肌及脂肪代谢的研究，为骨骼肌生长发育的调控、脂肪相关疾的探索和猪新品种的培育提供研究基础。