蛛网膜下腔出血后脑内核因子-κB“双向”作用的实验研究

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后脑内的病理过程以及机制目前尚未完全清楚。申请人的前期研究发现SAH后脑组织内核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在早期和后期各有一个激活高峰，结合其他相关研究，我们提出SAH后脑内NF-κB在不同时期的激活是其"双向"作用的体现，即早期的脑损伤和后期的脑修复作用。本课题拟通过体内、体外研究，运用抑制剂及基因干扰技术，针对脑内NF-κB的两个主要亚单位：p65与c-Rel，结合炎症和凋亡这两个机制，深入探讨SAH后NF-κB"双向"作用产生的分子机制。通过本课题的研究，可进一步明确NF-κB在SAH中的作用，为后续进一步的研究提供基础，为今后开展针对该靶点的治疗提供实验依据。

本项目研究分为两个部分：.第一部分 实验性蛛网膜下腔出血后体内外核因子-κB的双相激活. SAH后NF-κB被激活已成共识，但是SAH后NF-κB激活的完整过程尚不得知。在此研究中，将培养的神经元分成对照组和6个血红蛋白（Hb）处理组。制作兔一次注血SAH模型，并将兔子随机分为对照组和5个SAH组。采用电泳迁移率变动分析（EMSA）和免疫组化检测NF-κB活性及其在细胞内定位，实时定量聚合酶链反应（PCR）检测NF-κB下游基因TNF-α，IL-1β，Bcl-2，caspase-3表达。神经元特异性核蛋白（NeuN）荧光染色和乳酸脱氢酶（LDH）检测用来明确体内外的神经元损伤。在SAH后的兔脑皮层和体外培养神经元中，我们发现了NF-κB的激活双峰，其下游基因表达也呈相应的双峰变化。兔脑皮层中的NeuN阳性细胞数在3天和10天组显著降低。Hb处理的神经元LDH显著升高，但所有的处理组之间未有明显差异。以上这些结果证实了SAH后的NF-κB激活呈双峰变化，早期的NF-κB激活可能对神经元有损伤作用，但是晚期的激活可能不引起神经元损伤。.第二部分 兔蛛网膜下腔出血后核因子-κB在脑损伤中的“双向”作用. 在多种生理病理过程中， NF-κB都是一种重要的转录因子，其可能起到保护性或损伤性的作用。此研究中，我们旨在探究SAH后NF-κB的激活双峰在神经元损伤中的作用。本实验将80只新西兰大白兔分为对照组、SAH组、溶剂处理组、PDTC处理组，EMSA和免疫荧光分别用来检测NF-κB活性及其在细胞内定位。NF-κB下游炎性因子TNF-α，IL-1β和凋亡因子Bcl-2，caspase-3水平分别使用酶联免疫吸附分析(ELISA)和实时定量PCR检测。尼氏染色和免疫荧光染色评价神经元损伤。SAH后脑皮层中的NF-κB活性呈现双峰，炎性因子水平呈现出相同的时相改变。PDTC可以显著抑制NF-κB激活和炎性因子基因和蛋白表达，抑制早期的NF-κB活性峰可以显著增加神经元数量，但是抑制晚期的NF-κB活性峰能够显著减少神经元数量。SAH后脑皮层中的NF-κB双峰激活对神经元的损伤起到重要作用。早期的NF-κB激活起到脑损伤作用，晚期NF-κB激活起到保护性作用。.该项目培养博士生5人，相关的成果已发表SCI论文5篇。