KIAA1199在类风湿性关节炎滑膜细胞增殖及血管翳生成中的作用机制研究

We identified that KIAA1199 protein is overexpressed in RA synovial fibroblasts significantly by comparative proteomics, and confirmed that it promote HUVEC cell migration. KIAA1199 has a characteristic structure, related to hearing and promotes cell proliferation as abnormal expression. These result remind us that KIAA1199 may promotes the proliferation of synovial cells and plays an important role in RA pannus formation. This project to be adopted: overexpression and knock down KIAA1199, RA synovium proliferation capacity was detected by MTT and flow cytometry and analysis of MAPK pathway activation status; intended to verify the angiogenesis function by vitro 3D angiogenesis and chorio allantoic membrane model and the relationship with CTGF/SEMA5A/PLXNB3/KIAA1199 signal pathway; clinical samples of synovial fluid and serum were collected for determination of KIAA1199 expression. Investigate the cell proliferation、angiogenesis role and clinical significance of KIAA1199. This project aims to reveal the exact function of KIAA1199 in RA and to clarify the mechanism of pannus development promotion, to lay the foundation of KIAA1199 as a biomarker for clinical diagnosis and drug intervention targets.

课题组前期通过比较蛋白质组学在RA滑膜成纤维细胞中鉴定出表达显著上调的KIAA1199蛋白，并证实其具有促进内皮细胞迁移的功能。KIAA1199具有特征结构，与听觉相关，异常表达时与细胞增殖有关。上述提示KIAA1199可能通过促进滑膜细胞增殖在RA血管翳形成中有重要作用。本课题拟通过：过表达和敲低KIAA1199，MTT及流式细胞术观察RA滑膜细胞增殖能力，分析MAPK通路活化状况；拟在体外三维血管生成及鸡胚尿囊膜模型上验证其促进血管生成功能，及与CTGF/SEMA5A/PLXNB3/KIAA1199信号通路的关系；同时搜集临床RA不同活动期滑液及血清样本测定KIAA1199表达情况，探讨其在细胞增殖、血管生成中的作用及临床意义。本课题旨在揭示KIAA1199在RA中的确切功能，阐明其促进血管翳发生发展的机制，为KIAA1199作为生物标志物用于临床诊断及作为药物干预靶点打下基础。

KIAA1199基因是超大蛋白KIAA家族成员。人类KIAA1199基因位于染色体的15q25.1段。基因全长7080bp，编码150KD功能未知的KIAA1199蛋白。目前对KIAA1199蛋白的研究较少，发现在胃癌10、结肠癌9以及胰腺癌11等过度增殖的组织中KIAA1199蛋白的表达有不同程度上调。课题组前期蛋白质组学质谱鉴定及后期验证结果发现KIAA1199蛋白在RA滑膜成纤维样原代培养细胞高表达5.23倍。本实验运用大样本病例样本通过实时定量PCR和ELISA实验在RNA及蛋白水平验证了KIAA1199蛋白在活动期RA，非活动期RA及正常人滑膜组织，滑液及血清中的差异表达。ROC曲线分析结果发现非活动期RA血清，滑液和滑膜的曲线下面积分别为 0.74, 0.78和 0.79 ，表明有中等诊断价值。而活动期RA血清，滑液和滑膜的曲线下面积分别为 0.83, 0.92 和 0.91，表明有高等诊断价值，以在血清，滑液和滑膜样品中分别采用Cutoff 值为 90.13, 129.1 和198.7 μg/ml 诊断活动期RA的敏感性分别为72%, 84% 和 80%, 特异性分别为 80%, 93.3% 和 93.3%，以上结果说明KIAA1199对于活动期RA具有很好的诊断价值。通过MTT实验发现，KIAA1199蛋白促进成纤维样滑膜细胞增殖，细胞迁移实验，三维血管形成实验及鸡胚尿囊膜实验发现其具有血管生成作用。免疫组化实验结果发现KIAA1199在滑膜组织血管内皮细胞表达， RA滑膜组织中原代培养的成纤维样滑膜细胞进行的KIAA1199蛋白和CTGF蛋白的免疫荧光实验发现，两种蛋白共定位于胞液和胞膜处，而在胞核则为不表达或者低表达；RNA干扰和过表达实验初步证实了KIAA1199/PLXNB3/SEMA5A/CTGF轴与类风湿性关节炎血管翳生成相关。本实验结果为开发KIAA1199作为新的生物标志物用于RA的临床诊断，并作为药物干预新靶点用于抗风湿药物开发奠定基础。