锌离子和内质网应激传感器Ire1在心肌缺血再灌注损伤中的作用

There is no an effective therapeutic means for the treatment of myocardial ischemia/reperfusion injury caused by acute myocardial infarction. Our recent study showed that loss of zinc during reperfusion is associated with myocardial reperfusion injury and zinc applied at reperfusion could protect the heart from reperfusion injury by inhibition of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening through glycogen synthase kinase-3β. Our recent studies have also revealed that endoplasmic reticulum stress (ERS) occurs at reperfusion but not during ischemia. Inhibition of ERS with TUDCA could prevent reperfusion injury by modulating the mPTP opening and increased free zinc both in the cytosol and mitochondria. Therefore, zinc may play an important role in ERS. A decrease in the intracellular zinc may activate Ire1, an ERS sensor, but the role Ire1 in the development of ERS and the pathogenesis of the reperfusion injury is unclear. This project will adopt the methods of physiology, cell biology, and molecular biology to test: 1）If zinc loss at reperfusion can induce ERS. 2）If zinc loss can activate Ire1；3）If activated Ire1can induce ERS and reperfusion injury. This project will not only shed light on the role of the zinc and ERS sensor Ire1 in myocardial reperfusion injury but also provide new targets and strategies for the prevention of myocardial reperfusion injury.

急性心肌梗死引起的再灌注损伤尚无有效治疗方法。课题组前期研究表明，再灌注期心脏锌离子丢失与心肌再灌注损伤密切相关，锌离子通过GSK-3β抑制线粒体通透性转移孔（mPTP）开放减轻再灌注损伤。课题组最近研究表明，内质网应激（ERS）发生于再灌注期而不是缺血期，ERS抑制剂TUDCA通过抑制mPTP开放保护再灌注心肌，并增加胞浆和线粒体游离锌浓度，说明锌离子可能与ERS发生有关。Ire1是ERS传感器，细胞锌离子降低可激活Ire1，但其与心肌再灌注时ERS的发生及再灌注损伤的关系尚不得而知。本项目将利用生理学，细胞生物学和分子生物学等方法探讨：1）再灌注期心肌锌离子丢失是否诱发ERS；2）锌离子丢失是否激活Ire1；3）Ire1的激活是否诱发ERS和再灌注损伤。本项目将揭示锌离子和ERS传感器Ire1在心肌再灌注损伤中的作用，为防治再灌注损伤提供有效治疗靶点，为再灌注发生、发展机制提供新思路。

本项目通过2年的研究工作，已完成项目计划内容。.急性心肌梗死是威胁人类健康的重要疾病，早期再灌注治疗虽然可以减少心肌梗死面积、改善临床预后，但是缺血心肌血流恢复却可能引起更为严重的心肌再灌注损伤。对其机制的研究以及探寻防治抗再灌注损伤新的有效药物，一直是世界范围内心肌保护研究领域的难点和热点。本项目通过Lengandorff系统建立离体心脏缺血/再灌注损伤模型并分离培养心肌细胞，Power lab 心功能检测、TTC法测定心肌梗死面积、电感耦合等离子体发射光谱法（ICPOES）进行锌离子浓度测定、钙离子诱导的线粒体肿胀实验（mPTP开放实验）、Western blotting蛋白分析、激光共聚焦显微镜、电镜、组织学观察等方法，详细探讨了再灌注期心肌锌离子浓度变化及其对内质网应激的影响。结果显示，内质网应激伴侣分子GRP-78、GRP-94等在心肌缺血期未见明显增加，而在心肌再灌注期表达明显增多，外源性锌离子（氯化锌）及内质网应激抑制剂TUDCA能够明显改变此作用，提示内质网应激发生于再灌注期而不是缺血期，补锌可能通过内质网应激机制保护再灌注心肌。进一步研究显示，再灌注期心肌细胞锌离子大量减少，而内质网应激传感器Ire1表达明显增加，此作用被锌离子螯合剂TPEN所抑制。补充外源性锌离子及TUDCA能够明显改善心功能、减少心肌梗死面积、保护心肌细胞超微结构、明显抑制Ire1的表达，此作用同样被TPEN所抑制。激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体膜电位（TMRE）、细胞浆锌离子（Newport Green DCF）、线粒体锌离子（RhodZin-3）的荧光表达，结果显示，外源性锌离子及TUDCA明显抑制内质网应激诱导剂2-DG引起的线粒体膜电位减少，使细胞浆及线粒体内锌离子浓度明显增加，此作用被TPEN所抑制。以上结果提示，锌离子可能通过传感器Ire1介导“内质网-线粒体”交叉对话进而发挥心肌保护作用。对课题的深入研究显示，白藜芦醇、黄芪甲苷、腺苷等的心肌保护作用均通过抑制内质网应激进而阻止线粒体通透性转移孔的开放，锌离子可能介导“内质网-线粒体”交叉对话机制。