萝卜中两种双链RNA病毒侵染性克隆的构建及其共侵染关系研究

双链（ds）RNA病毒具有独特的基因组结构和复制特点，迄今只有个别动物和真菌的dsRNA病毒成功构建了侵染性克隆。课题组从萝卜中发现了6条1400-1800bp的未知dsRNA，经测序和基因组功能分析，确定其分别为双分病毒RasV1和RasV2的基因组片段，其中RasR1编码RasV1的复制酶亚基（RdRp），RasR2和6均可能编码该病毒的外壳蛋白（CP）；RasR3编码另一未知病毒的RdRp，RasR4和5功能未知，也可能编码CP。本项目拟利用Gateway技术构建表达不同组合以上病毒基因组片段的农杆菌双元载体系统，并侵染萝卜，筛选获得转病毒基因植株。通过核酸杂交、病毒粒子观察、dsRNA分析和病毒基因组定量分析，确定RasV1和RasV2的基因组RNA在寄主细胞中复制的量化关系，最终确定各基因组片段具体功能，并探讨病毒复制、组装机制和相互影响，探索dsRNA病毒的共侵染关系。

病毒和宿主在长期的互作过程中形成了不同的侵染方式。持续的慢性侵染的研究，一直以来被忽视，直到大量不引起明显症状的持续侵染的dsRNA基因组病毒从真菌、植物和某些原生动物中不断报道。本研究在一株一点红萝卜植株中克隆到6条双链RNA（dsRNA）条带，序列分析显示其组成2种dsRNA病毒。其中， RasR1，2和6组成RasV1，RasR3，4和5组成RasV2。在建立一点红萝卜品种组织培养体系的基础上，利用多位点Gateway技术构建表达2种组合的病毒基因组片段的农杆菌双元载体系统，并侵染萝卜和拟南芥，筛选获得了转病毒基因植株。通过基因组DNA杂交、Northern Bloting和RT-PCR均检测到阳性植株中病毒基因复制。但是dsRNA分析结果不稳定，且从阳性植株中未检测到病毒粒子。通过对芸薹属和萝卜属26个不同品种带种传dsRNA情况进行诊断调查，共发现五类不同的dsRNA，且通过低温处理和组织培养再生均无法从植物体内消除，台盼蓝染色光镜观察叶片组织，未发现内生真菌和共生菌，这些均排除了这些dsRNA来自真菌的可能性。通过本研究发展的未知dsRNA“单引物扩增技术”获得了至少4中新病毒的全长基因组序列，并分析了它们的起源和共侵染关系。通过ds3500对应的dsRNA进行全序列克隆测定，发现其由三条大小分别为3638, 3517 和 3299 bp，三者也同样具有同一种病毒保守的末端非编码区，其它已报道的青霉病毒序列的同源性最高，我们将其命名为Raphanus sativus chrysovirus 1；对萝卜中ds1900和ds1600两条未知序列进行全基因组克隆和测序，分析发现这些序列对应的三种不同的双分病毒，分别命名为Raphanus sativus partitivirus 1，Brassica rapa cryptic virus 1和Sinapis alba cryptic virus 1，分属于双分病毒科不同亚族。