Dnd1与Jun 的相互作用及其功能分析

2005年作者所在的研究小组发现与小鼠睾丸生殖细胞瘤（TGCT）相关的Ter位点中Dnd1基因突变导致TGCT。最近申请人又利用酵母双杂交系统, 成功筛选到4个与Dnd1相互作用蛋白, 其中之一为Jun蛋白，初步证实了Dnd1和Jun的相互作用；并发现Dnd1 基因在HeLa细胞系中的过表达抑制细胞增殖和诱导细胞周期G1期阻滞。本课题拟在以上研究发现的基础上利用GST-pull down技术确定Dnd1与c-Jun之间的相互作用区域；用免疫共沉淀等技术证明Dnd1与c-Jun特异性与生理性的结合；用报告基因等技术检测Dnd1对c-Jun的反式激活功能的影响；用缺失和诱导c-Jun 表达的细胞系统来证明c-Jun是否为Dnd1介导的细胞增殖抑制所必须，并分析Dnd1与c-Jun相互作用与细胞转化表型的关系。这为明确Dnd1的信号转导与其致瘤机制建立基础。

申请人所在研究小组前期发现Dnd1突变导致了小鼠TGCT，Jun蛋白是申请人利用酵母双杂交系统筛选的四个与小鼠Dnd1相互作用的蛋白之一。在此基础上，申请人研究团队利用GST pull-down实验验证了Dnd1与Jun蛋白的相互作用，经Co-Ip及激光共聚焦显微镜检测证实在GC-1细胞内这两种蛋白的存在特异性和生理性的结合。在GC-1细胞内，双荧光素酶报告基因技术检测到Dnd1与Jun蛋白结合后促进AP-1报告基因反式激活。成功构建Dnd1稳定高表达的GC-1细胞系后，经CCK-8实验及流式细胞学检测发现高表达的Dnd1对促进GC-1细胞的增殖，抑制GC-1细胞凋亡, 这与预实验瞬间转染的结果不同，显然稳定细胞系结果更为可靠。与此同时，运用RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）结合基因芯片检测发现Dnd1的靶标mRNA及共同参与的信号传递通路，免疫组化染色芯片检测发现Dnd1在人睾丸及多种肿瘤表达增高;我们还用我们建立的酵母栓杂交系统筛选了人Dnd1，初步发现了与人Dnd1相互作用的四个新基因。总之，Dnd1具有重要的生物学功能，调节细胞增殖及细胞周期等，Dnd1与蛋白及相关mRNA结合可能参与与多种肿瘤的发生和发展，详细的作用机制及信号传导通路还有待进一步研究。