疫霉菌性激素α1细胞受体及其相互作用蛋白的鉴定与功能分析

疫霉菌（Phytophthora）是一类世界性分布的毁灭性植物病原菌，其有性生殖对物种演化和延续起着重要作用。近期，调控疫霉菌有性生殖的性激素α1已被分离鉴定，但α1的细胞受体及其调控的有性生殖信号转导途径至今尚无报道。.本研究拟以致病疫霉为研究对象，①以亲和层析法纯化性激素α1的细胞受体，并通过质谱技术进行鉴定；②利用RNA干扰技术对受体基因的功能进行鉴定；③通过酵母双杂交技术鉴定有性生殖信号转导途径中α1受体的相互作用蛋白及二者的相互作用结构域；④通过RNA干扰技术对α1受体相互作用蛋白的基因功能进行鉴定；⑤利用荧光蛋白融合表达技术确定α1受体及其相互作用蛋白的细胞定位，以及二者在有性生殖过程中相互作用的变化。.该研究将为性激素α1调控的疫霉菌有性生殖信号转导途径分子机理的揭示奠定基础，并为马铃薯晚疫病等植物疫霉菌病害的有效防治提供新思路。

疫霉菌是一类世界性分布的毁灭性植物病原菌，其有性生殖对物种演化和延续起着重要作用。近期，调控疫霉菌有性生殖的性激素α1已被分离鉴定，但α1的细胞受体及其调控的有性生殖信号转导途径至今尚无报道。本研究以致病疫霉为研究对象：① 建立了疫霉菌遗传转化方法。原生质体转化法的转化率约为0.016‰，电转化法的转化率约为0.029‰，电转化是今后比较适合的疫霉菌转化方法。② 通过RT-PCR方法，检测了Pi-PIPKD5基因在A1、A2交配型菌株中的表达，并克隆了Pi-PIPKD5基因cDNA ORF序列。靶基因在A2菌株中表达量较高，但在A1菌株中的表达几乎检测不到。A2交配型菌株HQK8-3 的Pi-PIPKD5 基因cDNA ORF序列长2763bp，编码920个氨基酸的蛋白质。该序列与NCBI数据库中公布序列的一致性为99.03%，二者编码的蛋白质氨基酸序列的一致性是93.42%。③ 构建了Pi-PIPKD5基因的RNA干扰载体，通过RNA干扰技术研究其在疫霉菌有性生殖中的功能。然而，在多次转化筛选中，发现菌株生长出现异常，可能发生了真菌污染，相关实验重新再做，正在进行中。④ 构建了Pi-PIPKD5蛋白的荧光蛋白融合表达载体，以检测其细胞定位。然而，在后期的多次转化筛选、鉴定中，同样发现菌株的污染问题，因此，相关实验重做，正在进行中。⑤ 通过酵母双杂交技术鉴定Pi-PIPKD5的互作蛋白。构建了Pi-PIPKD5蛋白N端、C端序列的诱饵表达载体、及致病疫霉A2交配型菌株HQK8-3 的cDNA文库。Pi-PIPKD5蛋白的C端诱饵蛋白对酵母菌有毒性，所以，将Pi-PIPKD5蛋白的N端诱饵质粒与cDNA文库进行酵母双杂交，筛选到5个互作蛋白，其功能正在鉴定中。疫霉菌的有性生殖很复杂，尽管性激素已经被分离鉴定，但其含量极低，很难获得，且该菌很多实验操作方面的技术方法也存在一些问题，这些都大大限制了相关领域的研究。到目前为止，国际上能够查到的可以参考的资料很少，在不断的摸索中，我们遇到很多困难，导致研究速度缓慢。但我们坚信，该研究将为性激素α1调控的疫霉菌有性生殖信号转导途径分子机理的揭示奠定基础，并可能为马铃薯晚疫病等植物疫霉菌病害的有效防治提供新思路。