基因修饰骨髓间充质干细胞对乳腺癌的杀伤作用

The breast cancer incidence increased in the last decade, however, the method of treatment is limited. Several recent researches show the contribution of cancer associated fibroblasts(CAFs) to cancer development. CAFs can be identified by expression of fibroblast activation protein-α (FAPα), a cell surface dipeptidyl-peptidase not expressed by mature somatic tissues. The most powerful approach to deplete FAPα+ cells is a FAPα-selective peptide protoxin based on the unique peptidase activity of FAPα and this FAPα-selective theapy will be a promising method to treat kinds of cancers.Bone marrow esenchymal stem cells (MSCs) are able to migrate to tumor lesions and incorporate within the connective tissue stroma of various tumors. However, MSCs can be differentiaed to CAFs and promte cancer cells growth by tumor-derived TGFβ. Therefore, We hypothesize that inhibition of TGFβ pathway in MSCs can block their differentiation to CAFs in breast cancer, and inducible expression of FAPα-selective protoxin by these MSCs can eliminate endogenous CAFs, hence inhibit tumor growth and metastasis efficiently and safely.

肿瘤发病率逐年增加，但治疗手段有限。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤基质的重要组成部分，在肿瘤的生长、转移和免疫逃避中发挥重要作用。CAFs表达成纤维细胞激活蛋白α（FAPα），它具有二肽基肽酶活性，前蜂毒肽（Promelittin）可在其作用下酶解成蜂毒肽杀伤CAFs，从而抑制肿瘤生长。骨髓来源间充质干细胞（MSCs）有向肿瘤部迁移的特性，是肿瘤生物治疗的良好载体，但在肿瘤局部可受TGFβ作用下分化成肿瘤相关成纤维细胞并促进肿瘤生长。申请者在美学习期间成功构建基因修饰MSCs，从而抑制MSCs在肿瘤局部向CAFs的转化。我们拟利用载体构建、病毒包装、基因转染、RT-PCR、流式细胞、免疫荧光、荧光素酶报告基因和体内成瘤等技术，构建带有可诱导型前蜂毒肽基因的新型MSCs，以乳腺癌为研究对象，探索肿瘤治疗的新方法，并研究该方法对乳腺癌骨转移瘤及其他类型肿瘤的治疗作用。

肿瘤相关成纤维细胞来源可能是外周血中的MSCs或肿瘤局部的成纤维细胞，MSCs或成纤维细胞在肿瘤条件培养基或加入TGFβ的普通培养基培养一顿时间后能分化成肿瘤相关成纤维细胞并促进肿瘤的生长。我们的实验证实了MSCs在上述培养条件下，肿瘤相关成纤维细胞的一些标志物表达增加。MTT实验表明，商品化前蜂毒肽可以可以杀伤肿瘤条件培养基作用下的MSCs和普通成纤维细胞18Co，而对正常培养下的MSCs和18Co作用不大。这些结果提示：MSCs和普通成纤维细胞在肿瘤局部可分化成肿瘤相关成纤维细胞，从而促进肿瘤的生长，前蜂毒肽可有效杀伤肿瘤相关成纤维细胞，对普通组织的损伤则不大。.肿瘤分泌的TGFβ可能是诱导MSCs分化成肿瘤相关成纤维细胞的主要因子，因此阻断TGFβ通路就可能抑制MSCs向CAFs分化。BAMBI是TGFβ伪受体，能竞争性的抑制MSCs表面的TGFβ受体，阻断MSCs的TGFβ信号通路。构建带有BAMBI基因的慢病毒，转染MSCs发现BAMBI表达增高，TGFβ通路上关键分子Smad3表达降低，TGFβ信号通路受到抑制。前蜂毒肽可以特异性的与CASs的FAPα结合，酶切后生成有细胞毒性的蜂毒肽。构建可诱导型的前蜂毒肽基因的慢病毒，转染稳定表达BAMBI基因的MSCs。. 转染后的MSCs体外实验显示Dox诱导48小时后上清对活化的成纤维细胞有杀伤作用。这结果显示转染了新的基因后的MSCs仍然保持原生理学特性，且能成功分泌前蜂毒肽杀伤CAFs。体内实验使用NOD/SCID小鼠，6周后发现基因改良组MSCs组小鼠肿瘤体积明显小于其它两组，8周后处死小鼠，肿瘤组和肿瘤+MSCs组肿瘤体积较大，且有肺或肝脏转移，改良MSCs肿瘤体积较小，肿瘤中心可见圆形坏死灶，未见转移病灶。病理组织学检查可见MSCs组和改良MSCs组肿瘤和转移病灶内可见散在绿色荧光MSCs。这一结果显示改良过的MSCs能够迁移到肿瘤部位并发挥抗肿瘤的作用，并能减少肿瘤转移的形成。. 本研究证实了MSCs在肿瘤条件下能够分化成肿瘤相关成纤维细胞促进乳腺癌的生长和转移，构建了带有BAMBI和前蜂毒肽基因的MSCs能够定植于乳腺癌部位，并在乳腺癌局部发挥抗肿瘤的作用。