H3N2猪流感病毒HA、NA和NS片段宿主特异性相关位点变异的分子机制

Results of the global influenza virus type monitoring show that influenza A H3N2 is becoming prime strains. In the epidemiological investigation of swine flu in recent years, we isolated H3N2 influenza A virus from pigs. Pig airway epithelial cells with Neu5Acα2-3Gal and Neu5Acα2,-6Gal linked receptors, but poultry airway epithelial cells were mainly Neu5Acα2-3Gal and human were Neu5Acα2-6Gal linked receptors , therefore pig has been regarded as "mixed" role. Due to major public health significance and low bio-security requirements, The project intends to study the continuous passages of the H3N2 influenza virus in pigs, and compare with pandemic strains in human through genome analysis, especially difference of HA receptor-binding sites , derivate differences of the key amino acid in receptor binding, Genotype of stem-Motif of the NA genes, and differences of transcription initiation factor combined areas in NS1. Whether there has been the tendency to adapt to the human body, and changes of virus replication in the pig.The study provides a molecular basis for cross-species transmission, anti-influenza virus drugs targeting sites and research of the influenza vaccine of H3N2 influenza virus.

全球流感病毒亚型监测结果显示，甲型H3N2逐渐成为流感优势毒株。我们在近年的猪流感流行病学调查中，从猪体分离到H3N2亚型流感病毒。由于猪呼吸道上皮细胞同时具有Neu5Acα2-3Gal和Neu5Acα2-6Gal链接的受体，而人、禽呼吸道上皮细胞分别主要为单一链接的受体，所以猪一直被视为具有"混合器"的作用。由于猪流感的重要公共卫生学意义，和生物安全防护要求低，所以本项目拟研究H3N2流感病毒在猪体连续传代，通过与人群中流行毒株比较，分析H3N2八个基因片段，尤其是HA受体结合相关位点差异，推导受体结合的关键氨基酸位点差异，以及其NA基因"茎部-Motif"的基因型和NS1基因真核转录启动因子结合区域（eIF4GI）的氨基酸差异，是否发生了向人体适应的趋向，同时检测病毒在猪体的复制情况变化。这项研究为H3N2亚型流感病毒跨种间传播、抗流感病毒药物靶向位点、流感疫苗的研发提供了分子基础。

猪流感是由猪流感病毒引起的一种在猪群常发的急性传染性呼吸道疾病，其普遍存在于猪群中且根除困难。流感病毒具有较强的宿主选择特异性，禽流感和人流感病毒不易发生基因重组，但研究表明两者可以通过猪这一中间宿主来实现重组变异产生新毒株。其原因为：猪体细胞表面同时具有a-2,3半乳糖苷唾液酸受体和a-2,6半乳糖苷唾液酸受体，分别对禽流感病毒和人流感病毒有较强的亲嗜性，所以猪体可以同时感染人、禽、猪流感病毒，扮演着流感“混合器”的角色。采用血清学监测方法对猪流感的流行与分布情况进行调查，对流行的猪流感病毒毒株进行分离鉴定与遗传演化分析，具有重要的经济学价值和公共卫生学意义。.山东位于黄河下游，东临渤海、黄海，与朝鲜半岛、日本列岛隔海相望，且为候鸟迁徙途经路段，候鸟的迁徙扩增了流感病毒的基因库，山东是养猪大省，猪流感时有发生，对山东省猪流感病毒进行分离鉴定及遗传演化分析意义重大。本实验立足山东，对2013-2014年间送检的山东省各地区的猪血清样本共计1049份，用A型流感病毒ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。检测结果发现：猪流感在春冬两季抗体阳性率高，尤其是两季度中的12月份和3月份，分别为66.63%、55.90%；山东省内的鲁南和鲁西南地区，猪流感的抗体阳性检出率相对较高，分别为56.8%、55.3%，在胶东地区的抗体阳性检出率较低，仅为9.6%。.在山东省分离到两株猪流感病毒毒株A/Swine/ZC/90/2014（H1N1）和A/Swine/NJ/03/2014（H1N1）。两株分离株HA均含有7个糖基化位点，其中5个在HA1，2个在HA2；裂解位点均为QSR/GL，中间没有多个碱性氨基酸的插入，为低致病性的猪流感。两株分离株的HA、M、NA、NP基因与H1N1猪流感病毒的同源性最高，而NS、PA、PB1、PB2基因与H3N2猪流感病毒的同源性最高，推断两株病毒可能是由H1N1猪流感病毒与H3N2猪流感病毒重组变异而来。.H3N2亚型分离株在MDCK细胞上进行传代，并对F20代的病毒测序分析，与原代病毒进行比对，查看变异位点，推断变异趋势，致病力变化。比对结果显示：截止到F20代，分离株在个别位点发生变异，HA、NP蛋白分别有3个和2个氨基酸变异位点。动物试验也证明H3N2猪流感病毒F0代与F20代感染猪体时，均可产生典型的流感症状，体温升高和排毒时间延迟。