应用DNA窗帘荧光成像技术研究异质二聚体蛋白Ku与核小体的相互作用

DNA genomes are easily damaged by exogenous agents, like ionizing radiation, and endogenous processes, like DNA replication. Broken DNA will affect genomic integrity and stability, potentially leading to cancers and other diseases. The double-stranded DNA breaks (DSBs) are the most cytotoxic lesions, and if left unrepaired, they can lead to gross chromosomal rearrangements that are a hallmark of the most forms of cancers. To preserve genomic integrity, cells possess an arsenal of DNA repair proteins orchestrated into several DNA repair pathways, in which Ku has a key role..Cellular methods, like cell biology and genetics, and molecular methods, like biochemistry, molecular biology, and structural biology, have made tremendous progress in understanding Ku. However, even until now, it is still not clear the mechanism how Ku gives its function in DNA repair pathways. One of the important reasons is nucleosome..We utilize the new developing single-molecule imaging technique – DNA curtains to study how nucleosome affects Ku binding on the free end of dsDNA by reconstituting nucleosomes on DNA substrates. To understand the underlying mechanism, ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes are introduced. We will also use the new coarse-grained molecular dynamics to simulate the dynamics of Ku on chromatin curtains.

双链DNA断裂是最严重的DNA损伤，引发癌症和其他遗传疾病。蛋白Ku在其修复机制中占据核心地位，引起广泛研究。然而到目前为止人们仍旧不清楚Ku如何在修复路径中发挥作用，其中一个关键原因就是核小体。.本课题的重要特色就是利用最新发展的DNA窗帘荧光成像技术在体外研究Ku和核小体的相互作用。DNA窗帘可以提供一个强大和灵活的实验平台，使我们可以对成百上千的单独化学反应进行观测与统计分析。申请人计划在DNA上绑定核小体，制备核小体－DNA为底物的DNA窗帘平台，用于研究核小体对Ku与DNA的相互作用的影响。申请人同时引入依赖三磷酸腺苷的改变核染质结构酶，猜想它可以通过改变核小体的位置来帮助Ku附着在DNA的自由末端。另外本课题横向比较细菌、酵母与人类的Ku，有助于理解Ku的生物演化过程。

双链DNA断裂是最严重的DNA损伤，引发癌症和其他遗传疾病。异质二聚体蛋白Ku70/80在其修复机制中占据核心地位，引起广泛研究。然而到目前为止人们仍旧不清楚Ku如何在修复路径中发挥作用。例如Ku结合到DNA断裂末端是如何选择非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ），而又可以成功阻碍同源重组(homologous recombination, HR)？为了研究这些问题，项目负责人的课题组利用面上经费搭建了最新发展的单分子荧光技术-DNA窗帘，在单分子水平上观测其识别并结合DNA末端的动态过程。DNA窗帘技术的优势是可以提供一个强大和灵活的实验平台，使我们可以对成百上千的单独化学反应进行观测与统计分析。.本面上项目的取得的重要结果为：（一）项目负责人的课题组成功在体外纯化了酿酒酵母（S. cerevisiae）体系的异质二聚体蛋白Ku70/80，并在生化实验中证明Ku可以结合DNA。在把Ku标记荧光之后，项目负责人的课题组在DNA帘幕平台上成功观测到Ku识别并结合DNA末端的动态过程；（二）项目负责人的课题组在体外纯化了酿酒酵母（S. cerevisiae）体系的组蛋白，组装八聚体，并在生化实验中证明八聚体可以结合DNA。在把八聚体标记荧光之后，项目负责人的课题组在DNA帘幕平台上成功观测到有八聚体结合的DNA底物。项目负责人的课题组发现Ku70/80有能力在组蛋白八聚体存在的情况下结合到DNA末端；（三）项目负责人的课题组在体外纯化了酿酒酵母（S. cerevisiae）体系的Exo1以及Dna2和RPA，并在DNA帘幕平台上成功观测到Exo1或Dna2-RPA复合体对DNA底物的末端切割。这些关键数据让项目负责人及其团队进一步提出假设：核小体八聚体与Ku70/80的相互作用可以阻挡Exo1+RPA，和Sgs1+Dna2+RPA修复通路。这些结果对理解双链DNA断裂修复的通路选择具有非常重要的科学意义。