类免疫球蛋白Hemolin参与美国白蛾免疫应答HcNPV侵染机制研究

Hemolin protein plays an important role in the immunization and development of Lepidoptera insects. However, the interaction mechanism of insect and virus immunization still has not been studied and the mode of action of HcNPV has been rarely reported. In our recent study, we obtained the full length of in Hyphantria cunea and found that Hemolin gene significantly expressed by HcNPV induction. In this project, we intend to further study the molecular mechanisms of Hemolin in response to HcNPV infection using E. coli expression system and RNAi technology as follows: (1) the spatio-temporal expression analysis of Hemolin gene in Hyphantria cunea; (2) the effects of Hemolin silencing by RNAi on the growth and development of Hyphantria cunea larvae and its response to HcNPV stress; (3) Hemolin protein expression, purification and activity of anti-HcNPV; (4) Hemolin activity on HcNPV agglutination. This study contributes to clarify the molecular mechanisms of the immune response of Hemolin protein in Hyphantria cunea to HcNPV infection, and provides theoretical basis for developing the molecular synergist of HcNPV to improve the biocontrol of fall webworm.

Hemolin蛋白在鳞翅目昆虫免疫与发育过程中起着重要作用，但在昆虫与病毒免疫互作中的作用机制尚乏研究，在美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）致病机理方面更鲜有报道。申请人前期研究克隆分析获得世界性检疫害虫美国白蛾Hemolin基因全长，并发现HcNPV显著诱导其表达。本项目拟进一步利用大肠杆菌异源表达系统和RNAi技术从以下几个方面探讨Hemolin参与HcNPV侵染美国白蛾的分子致病机制：（1）Hemolin基因时空表达分析；（2）Hemolin沉默对美国白蛾幼虫生长发育及响应HcNPV胁迫的影响；（3）Hemolin蛋白表达、纯化与抗HcNPV活性；（4）Hemolin蛋白对HcNPV的凝集活性。项目的完成将有助于阐明美国白蛾HcNPV致病分子机制，为进一步寻找HcNPV分子增效剂增加生物防治效果提供理论依据。

类免疫球蛋白（hemolin）是鳞翅目昆虫在进化过程中独立进化出的一种免疫球蛋白家族成员。hemolin不仅影响昆虫的正常发育进程，且在昆虫的免疫防御系统中起着重要的作用。我们以重大检疫害虫美国白蛾为对象，研究了hemolin对美国白蛾生长发育、NPV胁迫响应及在NPV胁迫下的免疫分子机制。hemolin时空特异性显示，在各虫态和各组织中均有不同的表达，有趣的是hemolin在生殖腺中表达较高，推测其可能参与美国白蛾生殖。随NPV胁迫浓度的增加hemolin的转录水平以诱导上调为主，说明hemolin在NPV胁迫过程中起着积极响应的作用。hemolin沉默美国白蛾幼虫的生长率、取食量、食物利用率、食物转化率均显著低于对照组NC，表明hemolin可能与幼虫正常的生长发育相关；沉默hemolin的美国白蛾幼虫对NPV更为敏感，沉默120h，dshemolin美国白蛾实验组死亡率为55%，对照组GFP为10%。表明hemolin对美国白蛾幼虫抵御病毒的侵染具有一定的积极作用。.我们将hemolin基因成功构建pET28a载体中，通过一定浓度IPTG诱导，经SDS-PAGE和Western blot验证其表达，纯化hemolin蛋白后，注射于美国白蛾幼虫体内，对照组和实验组的半数致死时间分别是2d和4d，对照组在5d全部死亡，而此时实验组的美国白蛾有33.33%的存活率，说明hemolin蛋白具有抗病毒活性。这一研究结果为hemolin作为HcNPV作用新靶标，提高HcNPV防治效果提供了科学依据，为通过遗传工程手段合成双链hemolin基因培育抗虫林木奠定基础，对美国白蛾的绿色防控技术具有重要的指导意义。