基于质谱的Super SILAC技术解析Zn离子相关蛋白复合物对Ⅲ型前列腺炎的调控机制研究

Zinc plays an important role in prostate. Our previous study found that the concentration of zinc with Category Ⅲ prostatitis patients decreases in EPS, and rises in sera. We also found a set of zinc-interacting proteins expressed abnormally in serum of patients with Category Ⅲ prostatitis using iTRAQ-2DLC-MALDI-TOF tandem mass spectrometry. Functional studies show that there are complex interactions among them. Meanwhile, these proteins were also detected in prostatic tissue and EPS by WB, IHC and ELISA. Their expression levels are fluctuant according to the change of Zn concentration, and the trends are different. These results suggest that zinc plays a role by different protein complex with different regulated modules. In this study, we are going to take advantage of zinc enrichment material and a new mass spectrometry-based quantitative proteomics technology named Super SILAC to establish a method to obtain and identify zinc-interacting protein complexes. After that, human EPS samples and animal prostates will be used for getting the zinc-interacting protein network in Category Ⅲ prostatitis. The key proteins will be obtained by the functional studies and validation experiments in vivo and in vitro. These will help clarify the zinc associated pathogenesis of Category Ⅲ prostatitis, and help develop new therapeutic strategies.

Zn在前列腺中具有重要作用。前期研究表明Ⅲ型前列腺炎的前列腺液（EPS）中Zn离子浓度降低，血清Zn浓度上升；同时以质谱为基础的iTRAQ- 2DLC-MALDI-TOF-MS蛋白质组技术发现，血清中一组Zn离子相关蛋白在Ⅲ型前列腺异常表达，功能分析显示这些蛋白之间存在相互作用；ELISA、免疫组化及WB发现，这些蛋白在前列腺组织及EPS中表达，且与Zn离子浓度变化呈现不同的变化趋势。提示在前列腺中，Zn离子通过调控多个蛋白复合物，利用不同的信号转导调控模式发挥作用。本研究拟制备Zn离子富集材料，结合基于质谱的Super SILAC定量蛋白质组学新技术，建立解析Zn离子相关蛋白复合物的方法；利用临床EPS样本和动物模型，鉴定Ⅲ型前列腺炎中的Zn相关蛋白调控网络；通过体内外实验进行验证及功能研究，得到具有临床意义的蛋白若干，明确Ⅲ型前列腺炎与Zn离子相关的调控机制，为发展新治疗策略提供依据。

Ⅲ型前列腺炎是 50 岁以下男性最常见的泌尿外科疾病，因其发病率高、治疗效果差而广受关注。前列腺是人体内含锌（Zn）量最高的器官。Zn离子对维持前列腺的正常功能具有重要作用，但其具体调控机制仍未阐明。课题组前期研究发现Zn离子浓度及多个Zn离子相互作用蛋白的表达在Ⅲ型前列腺炎中发生改变，提示Zn离子可能通过调控多个蛋白复合物，利用不同的信号转导模式发挥作用。本研究制备Zn离子富集材料（已申请专利），结合近年出现的基于质谱的Super SILAC定量蛋白质组学新技术，建立解析Zn离子相关蛋白复合物的方法。在人Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液（EPS）中鉴定到Zn调控相关蛋白269个，其中上调163个，下调106个。同时，构建Ⅲ型前列腺炎大鼠模型，在组织中鉴定到Zn调控相关蛋白211个，其中上调77个，下调134个。对这些鉴定到的蛋白进行功能分析，绘制Zn离子相互作用的蛋白网络图。此外，通过同源性分析，构建同源的人差异表达数据库。综合分析所有数据，调研发现部分基因序列的变化与前列腺疾病的关系值得商榷，如雄激素受体基因中≤16的GGN重复不增加患前列腺癌的风险；XDP多态性位点Asp312Asn可能增加亚洲人及非洲人前列腺癌的患病风险，Lys751Gln、Arg156Arg则没有关系。此外，课题组选取了验证通过的关键调控蛋白2个，构建基因沉默（RNAi）或者过表达载体，转染前列腺细胞株（癌、正常、增生），构建稳转细胞株，研究体内体外关键蛋白表达改变对细胞功能的影响。结果显示这些蛋白与细胞增殖及侵袭有关。最后，在人Ⅲ型前列腺炎血清中通过基于质谱的MRM技术检测了相应的靶蛋白肽段的表达，并探讨其临床诊断意义。本研究为最终明确Zn离子的蛋白网络调控机制，深入了解Ⅲ型前列腺炎的病因及发病机制，为临床诊断及开发治疗前列腺炎的药物和方法，开辟新的治疗途径提供依据。