细胞外囊泡通过调节CD47抑制巨噬细胞功能从而促进动脉粥样硬化的作用及其机制研究

Atherosclerosis (AS), which could be characterized by progressive accumulation of lipids and inflammatory cells, will finally result in the acute cardiovascular event. Increasing evidence has shown the regulatory effect of extracellular vesicles (EVs) in vascular homeostasis. Although the effect of EVs on the process of AS remained still unclear, our preliminary results exhibited that the EVs accelerated the development of atherosclerotic plaque in ApoE-/- mice, indicating the potential relationship between the EVs and AS. In this project, we plan to investigate the role of EVs in AS process for the first time. To confirm the promotive role of EVs in AS process, the ROS, LDH and inflammatory cytokines will be measured after the EVs are injected into ApoE-/- and LDLR-/- mice. Afterwards, the immune suppression role of the EVs will be studied by the phagocytosis assay, and the expression of CD47 on the EVs membrane will be evaluated as well. Finally, the interaction between the CD47 and the SIRPα will be determined by co-immunoprecipitation and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), while the phagocytosis-related protein such as F-actin, Myosin-II, PAK and FAK will be also analyzed. Our research will elucidate that the extracellular vesicles contribute to the process of atherosclerosis through the CD47-dependent immunosuppression of macrophages, which will highlight a potential approach for AS therapy.

动脉粥样硬化是大多数心脑血管疾病的病理基础，其发病机制尚不明确。最新研究表明，细胞外囊泡在维持血管稳态方面至关重要，然而其是否能调控动脉粥样硬化的病程尚不清楚。我们的前期研究首次发现了ApoE-/-小鼠血液中的细胞外囊泡能促进动脉粥样硬化斑块的生长。基于此，我们推测细胞外囊泡与动脉粥样硬化关系密切。在本课题中，我们将首次探讨细胞外囊泡在动脉粥样硬化中的作用及机制。我们将研究细胞外囊泡对于模型小鼠血管内ROS、炎症等的影响，系统地探讨其对于动脉粥样硬化病程的作用，并同时研究细胞外囊泡的来源。随后，我们将观察泡沫巨噬细胞来源的囊泡上CD47表达和其对于正常巨噬细胞功能的抑制作用，并通过STORM等方法进一步确定囊泡上CD47与正常巨噬细胞上SIRPα分子的相互作用。最后，我们通过研究SIRPα的相关通路，深入探究细胞外囊泡通过调节CD47抑制巨噬细胞功能从而促进动脉粥样硬化的机制。

本项目完成了当时计划的研究任务。团队第一步系统性地探讨了CD47通过细胞外囊泡促进动脉粥样硬化的作用及其机制。首先，我们通过免疫电镜和流式细胞术等方法明确了细胞外囊泡及其上CD47的水平随患者动脉粥样硬化的病程显著增加。其次，流式细胞的结果显示患者CD47+细胞外囊泡上CD68的水平显著上升，提示CD47+囊泡主要来源于巨噬细胞。并且，这些细胞外囊泡对于巨噬细胞的吞噬功能有显著的抑制作用。进一步的研究发现，患者血液中的细胞外囊泡主要来源于巨噬细胞，且囊泡的数量及CD47的水平均与脂代谢呈正相关，这就说明这些细胞外囊泡可能来源于粥样硬化斑块内的泡沫细胞。根据这一提示，我们通过ox-LDL和胆固醇在体外的RAW264.7细胞和PMA-THP-1细胞中模拟了泡沫细胞，通过Western blot和共聚焦的方法研究发现，泡沫细胞确实能分泌大量带有CD47的细胞外囊泡，并且这些囊泡能通过CD47与巨噬细胞相互作用，抑制巨噬细胞的吞噬功能。最后，体内实验结果表明高血脂能显著诱导体内带有CD47囊泡的产生并形成动脉粥样硬化斑块，而带有CD47的细胞外囊泡则能进一步促进动脉粥样硬化的发展。在第二步的研究中，我们们进而探讨了靶向CD47治疗动脉粥样硬化的可行性。我们设计并在CHO细胞中表达了重组SIRPα-Fc融合蛋白，并且分别在体外巨噬细胞、平滑肌细胞来源的泡沫细胞以及ApoE-/-小鼠体内探讨了该融合蛋白治疗动脉粥样硬化的作用及机制。最后，我们建立了融合蛋白与抗体药物作用和机制研究平台，在研发如抗ANGPTL3和VEGF-B VHH抗体等候选药物分子的同时，进一步探讨了大分子药物对于细胞的作用及其相关机制，为进一步研究如动脉粥样硬化等重大疾病的治疗策略奠定前期工作基础。项目中，以本课题为主要资助发表了SCI论文3篇，另有3篇SCI论文在投稿中，申请国家发明专利5项，培养了毕业硕士研究生3名，博士研究生3名，另有1名博士研究生计划于2022年6月毕业。团队成员以本项目的研究结果为主要成果受邀参加了《脑卒中救治研究与转化论坛》，并申请获批了上海市青年科技启明星项目一项。