重连口服液通过Agr系统调控SCCmec剪切影响金葡菌甲氧西林耐药性机制研究

Resistance of Staphylococcus aureus has become an increasingly intractable problem, which has caused concern that there is no drug available in clinic.Our previous studies indicated that Chonglian Oral Liquid could reduce the resistance of MRSA to oxacillin and promote the expression of Agr quorum-sensing system of S. aureus. Bioinformatics analysis revealed that RNA III, the effector molecule of Agr system, is highly complementary to the reverse repeat sequence in ccrAB promoter, and possess the ability to regulate the excision of methicillin-resistant mobile genetic element SCCmec through CcrAB recombinase. We speculate that Chonglian Oral Liquid can regulate ccrAB expression through intervention of Agr system, promote SCCmec excision, increase the proportion of MSSA cells in MRSA population, and then improve the resistance of MRSA to oxacillin. With MRSA strains N315 and MW2 as models, and gene knockout and overexpression as methods, this subject is focused on exploration of molecular mechanism of Chonglian Oral Liquid regulating methicillin resistance of MRSA in respects of the regulatory mechanism involved in ccrAB expression and SCCmec excision by RNAIII, the effect of Chonglian Oral Liquid on methicillin resistance, Agr system expression and SCCmec excision of S. aureus, with the purpose to provide new idea and method for treatment of MRSA infection.

金葡菌耐药性成为日益棘手的难题，已引起临床无药可用的担忧。课题组前期研究表明中药重连口服液能够降低MRSA对苯唑西林的耐药性，促进金葡菌Agr群体效应系统的表达。生物信息学分析显示Agr系统效应分子RNAIII与ccrAB启动子中的反向重复序列高度互补，具有通过重组酶CcrAB调控甲氧西林耐药性可移动遗传元件SCCmec剪切的能力。我们推测重连口服液能够通过Agr系统调控ccrAB表达，促进SCCmec剪切，增加MRSA群体中MSSA细胞的比例，进而改善MRSA对苯唑西林的耐药性。本课题拟以MRSA菌株N315和MW2为模型，以基因敲除和过表达为手段，从RNAIII调控ccrAB表达及SCCmec剪切的机制，重连口服液对金葡菌甲氧西林耐药性、Agr系统表达及SCCmec剪切的影响等不同层面探讨重连口服液调控MRSA甲氧西林耐药性的分子机制，以期为治疗MRSA的感染提供新思路和新方法。

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是一种重要的人畜共患病原菌，SCCmec可移动遗传元件是其甲氧西林耐药性出现的基础。本课题在前期SCCmec元件剪切调控机制研究的基础上，结合中药多途径多靶点的特点，探索了本单位制剂重连口服液单独或联合苯唑西林使用时对金葡菌的抑菌效果及可能机制。我们构建了Agr系统敲除和过表达菌株，并对相关基因进行了分析，结果显示Agr系统可以调控ccrAB基因的表达和SCCmec的剪切，但是这种调控并不是直接的；通过pull-down实验我们发现了可能直接结合ccrAB启动子的调控因子SpoVG、SarV和Rot，EMSA证实了它们的相互作用关系，但是仅有敲除SpoVG影响了ccrAB基因的表达和SCCmec的剪切。通过耐药性分析，我们证实了重连口服液的抑菌和杀菌效应，且重连口服液能够明显降低MRSA菌株对苯唑西林的耐药性。定量PCR的结果显示，重连口服液能够影响N315和MW2菌株Agr系统的表达，调控N315菌株ccrAB基因的表达和SCCmec的剪切，并且调控MW2菌株mecA基因的表达。此外，转录组测序的结果显示，重连口服液有效抑制了N315菌株胞外蛋白相关基因的表达，可能影响了其生物膜形成能力。通过LC/MS，我们鉴定了重连口服液中103种主要化学成分，通过对其中主要成分的耐药性分析，我们发现黄芩素能够明显抑制N315菌株的甲氧西林耐药性。本研究揭示了Agr系统、SpoVG在ccrAB表达和SCCmec剪切过程中的调控作用，阐释了重连口服液对MRSA菌株甲氧西林耐药性的影响及可能机制，明确了重连口服液有效成分黄芩素对甲氧西林耐药性的影响，有望为临床MRSA感染的治疗提供新策略。