中性粒细胞丝氨酸蛋白酶在特发性炎性肌病肌肉淋巴细胞浸润中的作用及机制研究

Muscle damage caused by the infiltrated lymphocytes plays an important role in the pathogenesis of idiopathic inflammatory myopathy (IIM). Neutrophil serine proteases (NSPs) is crucial in increasing the permeability of vascular and promoting the chemotactic ability of inflammatory cells, but its functions in the lymphocytes infiltration of muscles tissues in IIM are not clear. Our previous study found the mRNA expression of NSPs(NE、CTSG and PR3) is increased in the peripheral blood mononuclear cell via microarray analysis and real-time PCR; the serum concentration of NE and PR3 and the activity of CTSG is increased; the concentration of NE and PR3 is increased in the muscle tissues of IIM. We hypothesize that NSPs could promote the lymphocytes infiltration in muscle tissues and participate in the pathogenesis of IIM. In this study, we will first detect the expression and activity of NSPs and confirm the secretory cells. Further, we will study the role of NSPs in the lymphocytes infiltration in muscle tissues both in cells and animals and related mechanism. Then we will construct recombinant human skeletal C-protein induced experimental autoimmune myositis mice and explore the possibility of intervening NSPs activity in the treatment of IIM. This study will help to elucidate the pathogenesis of IIM and provide new theoretical basis for the treatments of IIM.

淋巴细胞在肌肉中浸润引起组织损伤在特发性炎性肌病（IIM）的发病中有重要作用。中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）具有增加血管通透性、促进炎症细胞趋化的作用，但其在IIM肌肉淋巴细胞浸润中的作用未见报道。申请者前期利用芯片和PCR筛选发现NSPs（NE、CTSG和PR3）mRNA在IIM外周血单个核细胞中表达增高；血清中NE、PR3浓度增高、CTSG活性增加；肌肉组织中NE和CTSG增加；内皮细胞经IIM血清孵育后其骨架蛋白和连接蛋白均发生变化。因此提出“NSPs通过促进淋巴细胞浸润至肌肉组织参与IIM发生发展”的假说。本项目首先明确NSPs的表达部位、活性和细胞来源，从细胞和整体动物水平研究NSPs在淋巴细胞浸润中作用及机制。构建人骨骼肌C蛋白诱导的IIM动物模型，探讨干预NSPs活性治疗IIM的可能性。开展本研究，将为阐明IIM的发病机制并以NSPs为靶点进行治疗提供新的理论依据。

特发性炎性肌病（IIM）是一组病因未明的以对称性的近端肌无力、血清中肌酶升高为主要临床特征的自身免疫性疾病，皮肌炎（DM）、多发性肌炎（PM）是IIM主要的疾病亚型。淋巴细胞在肌肉组织中浸润引起肌肉损伤在IIM的发病过程中具有重要作用。中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）具有增加血管通透性、促进炎症细胞趋化的作用，但其在IIM肌肉淋巴细胞浸润中的作用未见报道。本课题首先利用全基因组DNA甲基化芯片和基因表达谱芯片筛选出存在差异的DNA甲基化位点和基因，综合分析DNA甲基化位点与基因表达之间的关系，发现TOP30的基因及其甲基化位点之间存在明显的负向调控关系。我们选取在DM和PM患者外周血中均为高表达低甲基化水平的基因（CTSG、NE和PR3）进行进一步的机制研究。亚硫酸氢焦磷酸测序和Real-time PCR验证基因NSPs（CTSG、NE和PR3）呈低甲基化，高表达。采用酶联免疫吸附方法，发现DM/PM患者血清中CTSG、NE和PR3的水平升高，并发现其与DM/PM患者的乳酸脱氢酶、红细胞沉降率、C反应蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A等临床指标呈正相关。免疫组化和免疫荧光方法发现CTSG、NE和PR3在DM/PM肌肉组织中表达增加。用DM/PM患者的血清培养人皮肤微血管内皮细胞，DM/PM患者血清的NSPs可裂解血管内皮细胞的VE-钙黏素，减弱血管内皮细胞的成管能力，增加其对外周血单个核细胞（PBMC）的跨血管迁移。本研究首次证明，DM/PM患者血清中的NSPs可降解人微血管内皮细胞间的连接蛋白VE-钙黏素增加微血管内皮细胞的通透性，促进炎症细胞的跨内皮细胞迁移。随着更多的研究发现，选择性NSPs抑制剂有望成为DM/PM患者新的治疗靶点。