不依赖微生物培养的纤维素酶筛选与人工组合酶系的研究

自然界天然纤维素的降解是特定生态系统中可培养微生物和未培养微生物分泌产生的多重降解酶系共同作用的结果，因此纤维素降解的特定生态系统是寻找新纤维素酶特别是未培养微生物纤维素酶的重要来源。本项目拟通过天然纤维素降解的特定生态系统样品的宏基因组文库的构建和宏蛋白质组中纤维素酶组分的分析，探讨特定环境中纤维素降解的相关机制以及自然环境中对纤维素降解起主导作用的酶组分。同时利用宏基因组筛选新型纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶基因，并获得活性表达，研究筛选到的各纤维素酶的催化特性；利用不同类别宏基因组纤维素酶组分之间以及与瑞氏木霉等纤维素酶组分的组合，探讨其相互间的协同作用，寻求最佳纤维素酶组分组合。通过该项研究，将会为微生物降解木质纤维素的机制提供新的观点，进一步丰富和完善纤维素的生物降解理论提。

自然界天然纤维素的降解是特定生态系统中可培养微生物和未培养微生物分泌产生的多重降解酶系共同作用的结果，这些生态系统是寻找新纤维素酶特别是未培养微生物纤维素酶的重要来源。本项目在实施过程中主要根据以上目标开展了系列研究工作：（1）通过活性电泳展示技术，对天然纤维素降解的特定生态系统秸秆堆肥和牛瘤胃液的样品进行了宏蛋白质组中纤维素酶组分的分析，证明这两个生态系统中存在丰富的纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，是筛选新纤维素酶基因的理想的环境样品。研究还发现脱离了菌体的纤维小体，丧失了对结晶度较高的固体纤维素底物的降解能力。（2）对秸秆堆肥中的微生物生态系统进行了跟踪调查。在两年多的时间先后分别采用以DNA指纹技术为基础的RFLP分析和以Roche 454高通量测序技术为基础的检测分析，对玉米和小麦秸秆堆肥的不同发酵阶段和同一肥堆不同区位的微生物多样性和纤维素酶活性进行了分析。研究发现堆肥中秸秆的降解主要发生在秸秆堆保温且通气较好的内层，喜热裂孢菌和嗜热丝孢菌是这个生境中的优势微生物。通过对堆肥的16S rRNA和18S rRNA基因文库筛选后的测序比对发现，无论是小麦秸秆堆肥还是玉米秸秆堆肥其中>50-60%的原核微生物是未培养的，>20%的真核微生物是未培养的。（3）对环境样品基因组中外切纤维素酶基因的多样性进行了分析。在本研究中，主要对以瑞氏木霉外切纤维素酶CBHⅡ为代表的GH6、以瑞氏木霉外切纤维素酶CBHⅠ为代表的GH7和嗜热、耐热纤维素酶类的GH48等家族中的纤维素酶基因进行了分析，并通过反转录作用获得了秸秆堆肥和牛瘤胃液的宏cDNA。研究表明，在天然纤维素降解的环境中确实存在许多未知的纤维素外切酶组分；GH7家族功能基因多样性在秸秆堆肥样品中的种类丰度较低；GH48家族的纤维素酶在秸秆堆肥中的多样性较为丰富；GH6家族的纤维素酶在牛瘤胃液中的多样性是丰富的，并从牛瘤胃液的宏cDNA中获得了部分该家族纤维素酶的全长基因。（4）选择了GH9家族的Umcel5e1和GH5家族的Umcel5e2作为代表对分离自宏基因组中的纤维素酶基因进行了克隆表达，只有来自牛瘤胃宏基因组的Umcel5c2基因能够被大肠杆菌有效表达。对分离纯化后的Umcel5c2蛋白的酶学性质进行了分析。本研究为新纤维素酶的筛选奠定了理论和技术基础，丰富和完善了纤维素的生物降解理论。