TNF-αB细胞表位MAP疫苗的表位预测、筛选、免疫原性鉴定及其对溃疡性结肠炎的治疗作用

As a self antigen, TNF-α has complex biological activities. When excessly expressed, a variety of pathological damages will be co produced , such as inflammatory bowel disease. Anti TNF-α monoclonal antibody (infliximab) is the most commonly used of biological agents in passive immune treatments, however, such drugs have significant defects as large dosage, the need for repeated use, easy to cause allergic reactions, high cost and inconvenient use. Nowadays, the active vaccine has become a new development direction, but due to its smaller molecular weight and single molecular structure, which often resulting in reduced immunogenicity, immune responses in vivo usually could not be ideally induced. However, the use of multiple antigenic peptides (MAP) scheme can enhance the immunogenicity of the antigen peptide. Based on our previous study on self antigen MAP vaccine,the purpose of this project is to design, synthesis of TNF-α B cell epitope MAP vaccine, and then through the observation of immune effect of the vaccine in vitro and in vivo, trying to clarify the feasibility of synthesis of TNF-α B cell epitope vaccine using the 8-brounched MAP design, , and to observe its immunogenicity as well as the therapeutic effect on the ulcerative colitis bearing BALB/c mice.

TNF-α作为一种人体自身抗原，具有复杂的生物活性，但当其过量表达时，会协同产生多种病理损伤，如炎症性肠病等。抗TNF-α单克隆抗体（英夫利昔单抗）是目前最常用的被动免疫治疗生物制剂，然而，此类药物存在用药量大、需反复使用、易引起超敏反应、生产成本高、使用不便等显著缺陷。而今，主动免疫疫苗已成为抗自身分子免疫治疗新的发展方向，但由于自体分子其分子量较小、结构单一，往往造成免疫原性降低，在体内不能诱发理想的免疫反应；而采用多抗原肽（MAP）设计方案能增强自身抗原肽的免疫原性。本项目在前期MAP疫苗的研究基础上，拟预测、筛选TNF-α B细胞表位，并设计、合成MAP疫苗，继而通过观察该疫苗体内外的免疫学效应，试图阐明采用MAP方案合成新型TNF-α B细胞表位疫苗的可行性、探明其免疫原性、及观察其对UC模型小鼠治疗的有效性。

TNF-α是一种具有复杂生物活性的细胞因子，也是一种可作为治疗靶点的自身抗原。目前，由被动地接受单克隆抗体药物转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗（即自体疫苗），已成为抗自身分子免疫治疗新的发展方向。研究发现将外源通用T辅助表位插入自身抗原分子的适合位置可以辅助自身分子突破免疫限制，诱发针对自身分子的中和性抗体；另外，近年新提出的多抗原肽设计方案不但能很好模拟天然表位构象，而且无需再偶联载体蛋白，便能激活体液免疫，诱生高滴度、高亲和力抗体。在本研究中，基于mTNF-α的一级结构，综合利用几种生物信息学技术预测mTNF-α B 细胞表位，与白细胞介素1β 163-171 通用型辅助表位肽连接，采用8 分支多抗原肽系统设计合成复合型MAP疫苗。继而通过观察该疫苗体内外的免疫学效应，以及对BALB/c小鼠UC模型DAI指数、血清DAO水平、结肠组织claudin1等紧密连接蛋白的表达及MPO活性等的影响，从而为研制溃疡性结肠炎TNF-α新型疫苗奠定基础。结果显示mTNF-α的第78-92位氨基酸LTLRSSSQNSSDKPV可能为其优势B 细胞表位，以此为基础合成了8分枝肽结构的TNF-αB细胞表位-IL-1βT辅助表位复合型MAP疫苗。间接ELISA 证实MAP与商品化mTNF-α抗体具有较高的亲和力，抗体滴度动态检测及免疫印迹表明MAP能诱导产生高滴度的特异性抗体，LDH释放实验表明MAP免疫血清能抑制mTNF-α杀伤L929细胞的生物学效应。体内试验结果显示，MAP疫苗能降低UC小鼠DAI评分、血清MPO活性、肠系膜淋巴结菌落计数、结肠组织HI评分及MPO活性，提高结肠匀浆中occludin、claudin1、ZO1的表达水平。 本研究结果初步表明，mTNF-α的第78-92位氨基酸为其优势B 细胞表位，我们成功的将通用型IL-1 T辅助表位与其偶联并构建8分枝MAP肽疫苗，证实了该MAP疫苗具有较好的抗原性及免疫原性，在体内能诱生出高滴度、高特异性的多克隆抗体；并可改善结肠炎小鼠 DAI 评分及结肠组织的HI 评分，降低血清MPO活性，具有显著的抗结肠炎与修复肠黏膜屏障作用，其机制可能与抑制TNF-a的生物学活性、上调occludin、claudin1、ZO1等紧密连接复合体结构蛋白的表达等有关。